Das Elicitorprotein NPP1 - Isolierung und Charakterisierung der korrespondierenden cDNA, heterologe Expression des Proteins und Studien zur Signalperzeption

Abstract

Pflanzen können den Angriff von Pathogenen durch die Induktion komplexer Resistenzreaktionen abwehren. Eine grundsätzliche Voraussetzung zur Aktivierung des pflanzlichen Abwehrsystems sind hoch sensitive und spezifische Perzeptionsmechanismen für mikrobielle Pathogene. Experimentelle Daten deuten darauf hin, dass in der pflanzlichen Plasmamembran hochaffine Rezeptoren für Pilz-/Oomycetensignale lokalisiert sind. Außerdem wird eine intrazelluläre Signaltransduktionskaskade angeschaltet, die die Aktivierung des Abwehrarsenals der Pflanzenzelle bewirkt. Ein 23-kDa-Elicitorprotein (NPP1, Nekrosen induzierendes Protein von Phytophthora), das aus dem Kulturmedium des Oomyceten Phytophthora parasitica isoliert wurde, induziert in dikotyledonen Pflanzen, einschließlich Petersilie und Tabak, den hypersensitiven Zelltod. Außerdem bewirkt NPP1 die Phytoalexinakkumulation und den Zelltod in Petersilieprotoplasten. NPP1-Homologe haben untereinander einen hohen Grad an Homologie. Heterolog exprimiertes NPP1 zeigte die gleiche biologische Aktivität wie das native Protein. NPP1-Deletionsderivate wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Phytoalexinakkumulation in Petersilie und den Zelltod in Petersilie und Tabak zu induzieren. Nur die Derivate, die die Phytoalexinbildung induzierten, bewirkten auch den Zelltod. Die Substitution zweier konservierter Cysteinreste in NPP1 durch in-vitro-Mutagenese ging mit dem Verlust der Fähigkeit einher, die Phytoalexinakkumulation und den Zelltod zu induzieren. Petersiliemembranen könnten eine Bindungsstelle für NPP1 enthalten, die die Aktivierung der pflanzlichen Abwehr in einer rezeptorähnlichen Art vermittelt. Zur Charakterisierung einer putativen Bindungsstelle wird ein Radioligand benötigt. Unter Verwendung einer cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) und [γ32P]-ATP war es möglich, einen Radioliganden mit einer spezifischen Aktivität von 40 Ci/mmol zu präparieren. Es konnte jedoch bisher keine Bindungsstelle detektiert werden.

Plants are able to defend themselves against pathogen attack with the initiation of a complex pattern of resistance reactions. A fundamental requirement for the activation of the plant`s surveillance system are highly sensitive and specific perception mechanisms for microbial pathogens. Experimental evidence indicates that high-affinity receptors for fungus-/oomycet-derived signals do reside the plasma membrane. Subsequently, an intracellular signal transduction cascade is initiated, triggering activation of the defence arsenal of the challenged host plant cell. A 23 kDa elicitor protein (NPP1, necrosis inducing protein from Phytophthora) purified from the culture filtrate of Phytophthora parasitica induces hypersensitive cell death in various dicotyledonous plants, including parsley and tobacco. In addition NPP1 trigger cell death and phytoalexin production in protoplasts derived from cultured parsley cells. NPP1 homologoues exhibit a high degree of homology among each other. Heterologously expressed NPP1 and the native protein show the same biological activity. NPP1 deletion derivatives were tested for their ability to induce phytoalexin accumulation in parsley and cell death in parsley and tobacco. Only those derivatives which induce phytoalexin production in parsley protoplasts also trigger cell death. The substitution of two conserved Cystein residues of NPP1 using in vitro mutagenesis results in a loss of the ability to induce phytoalexin accumulation and cell death. Parsley plasma membranes could harbour a binding site for NPP1, which mediates activation of plant defence responses in a receptor-like manner. Characterization of a putative binding site needs for radiolabeling of the protein. Using a cAMP dependent Proteinkinase (PKA) and [γ32P]-ATP a radioligand of 40 Ci/mmol could be prepared. However, no binding site has been detected.