Quantitative energiedispersive Elektronenstrahlmikroanalyse von Herzmuskelzellen: Einfluß von Fehlermöglichkeiten bei Präparation, Messung und Auswertung der Spektren auf die Signifikanz der Messergebnisse

Abstract

Untersucht wurden Einzelzellen vom linken Ventrikel von 15 Monate alten SHR-(Tiere mit Bluthochdruck und Herzhypertrophie) bzw. WKY-Ratten (Stamm Whistar Kyoto, gesunde Kontrolltiere). Nach einer Methode von Gallitelli und Isenberg erfolgte das Einfrieren der Einzelzellen an einem elektrophysiologischen Messplatz. Die Zellen wurden in einem Ultrakryomikrotom geschnitten und anschließend gefriergetrocknet. Die Zellschnitte wurden in einem Philips CM12 Elektronenmikroskop untersucht. Zur Detektierung der Röntgenstrahlung diente ein energiedispersiver Röntgendetektor. Die Berechnung der Konzentrationen erfolgte mit der Kontinuummethode nach Hall mittels gefiltertem MLSQ-Fit. Der verwendete Top-Hat-Filter wurde mit Hilfe simulierter Spektren optimiert. Eine mathematische Korrektur für Siliziumkontaminationen wurde in die Berechnungen einbezogen. Die Berücksichtigung von Zählrateneffekten reduzierte die Streuung bei den Messungen an Mitochondrien von Ventrikelmyozyten der Ratte um bis zu 13 % und korrigierte die Mittelwerte. Für zentral gelegene Mitochondrien ergab sich bei Messungen an 16 Zellen von 7 Tieren des Stammes WKY eine Calciumkonzentration von 0.33±0.91 mmol (kg d.w.)1 und für zentral gelegene Mitochondrien bei Messungen an 19 Zellen von 8 SHR-Ratten eine Calciumkonzentration von 0.34±0.85 mmol (kg d.w.)1. Die angegebenen Standardabweichungen sind unwesentlich größer als die Standardabweichung von 0.72 mmol (kg d.w.)-1, die für rein statistische Schwankungen berechnet wurde. Das bedeutet, dass die biologische Variabilität für diese Gruppe von Mitochondrien relativ klein ist. Es ergaben sich Calciumkonzentrationen von 0.66±1.23 mmol (kg d.w.)-1 für die WKY-Ratten und 0.65±0.90 mmol (kg d.w.)-1 für die SHR-Ratten für die peripher (also in Membrannähe) lokalisierten Mitochondrien. Der Unterschied der Calciumkonzentration zwischen den zentralen und peripheren Mitochondrien ist für die jeweilige Gruppe von Ratten signifikant auf einem Signifikanzniveau von 0.05. Hinsichtlich der Calciumkonzentration konnten nach Berücksichtigung aller untersuchten Einflüsse keine Unterschiede zwischen den Kontrolltieren und den spontan Bluthochdruck entwickelnden Ratten nachgewiesen werden.

We investigated single cells of the left ventricle of 15 month old rats. Here we compared spontaneous hypertensive rats (SHR) with healthy Whistar Kyoto rats (WKY). The cells were shock frozen with a method described by Gallitelli and Isenberg under electrophysiological conditions. The frozen cells were cut with a ultra cryomicrotom and freeze dried. The freeze dried cell pieces were investigated with a Philips CM 12 electron microscope and a energy dispersive X-ray detector. The calculation of element concentrations were done with the continuum normalization method (Hall) with filtered multiple least square fit. The top hat filter was optimised with simulation of spectra. A mathematical correction for contamination of silicon was used. The correction of the influence of count rate effects reduced the standard deviation by 13% and corrected the means. Mitochondria located in the centre of the cell shown a calcium concentration of 0.33±0.91 mmol (kg d.w)-1 for WKY-rats (16 cells from 7 animals) and a calcium concentration of 0.34±0.85 mmol (kg d.w)-1 for SHR (19 cells from 8 animals). The calculated standard deviation for only stochastic fluctuations (0.72 mmol (kg. dw)-1 was in the range of the standard deviations of the calcium concentrations. That means, the biological variability for this mitochondria is much smaller than the stochastic fluctuations of the measurements. The calcium concentrations for mitochondria located near the cell membrane (peripheral) were 0.66±1.23 mmol (kg. dw)-1 for WKY-rats and 0.65±0.90 mmol (kg. dw)-1 for SHR. The difference in the calcium concentrations of central and peripheral mitochondria was significant at a level of 0.05. The calcium concentrations of mitochondria of ventricle cells from healthy rats compared with spontaneous hypertensive rats shown no significant difference.