Molecular and functional characterization of amino acid and peptide transporters in developing seeds of Vicia faba L.

Abstract

Drei Aminosäure-Permeasen (AAPs) und zwei Oligopeptid-Transporter (OPTs) wurden aus samenspezifischen Bibliotheken von Vicia faba isoliert. Ziel ist es, den Transfer stickstoffhaltiger Assimilate in sich entwickelnde Samen und dessen Regulation besser zu verstehen zu lernen. Die funktionelle Charakterisierung in Hefe-Mutanten zeigte, dass VfAAP1 und VfAAP3 hohe Substrataffinitäten haben und verschiedene Aminosäuren transportieren, und dass VfOPT1 in der Lage ist eine Mutation im Peptidtransporter eines Hefestammes funktionell zu komplementieren. Northernanalysen zeigten für AAPs und OPTs spezifische und entwicklungsabhängige Expressionsmuster. Zusammengefasst zeigen die Expressionsprofile in den Kotyledonen, dass VfAAP1 eine wichtige Rolle während der Vor-Speicherphase spielt und dass beide Peptid-Transporter wichtig für die späte Samenentwicklung sein könnten. In situ Hybridisierungen zeigen, dass VfAAP1 mRNA im ganzen kotyledonären Parenchym verteilt ist. Das Muster gleicht dem der Speicherprotein-Gene. VfOPT1-Transkripte dagegen nur in Transferzellen der Kotyledonen. Die Verteilung von VfAAP1 mRNA ist bemerkenswert, da sie nicht mit Transfer- sondern mit Speicherparenchymzellen verknüpft ist. Transkripte von VfAAP1 und Speicherprotein-Gene wurden auf Transkriptionsebene durch Aminosäuren herunter- bzw. heraufreguliert. Um VfAAP1 überzuexprimieren wurden V. narbonensis Pflanzen transformiert. Transgene Samen mit erhöhter VfAAP1-mRNA haben höhere Gehalte von Stickstoff, Proteinen und Schwefel. Stärke hingegen war reduziert. Die Änderungen in der Speicherstoffzusammensetzung bestätigt die vermutete Rolle dieser Permease für die Aminosäureversorgung.

Three amino acid permeases (AAP) and two oligopeptide transporters (OPT) were isolated from seed-specific libraries of Vicia faba. Functional characterization in a yeast mutant showed that VfAAP1 and VfAAP3 have high substrate affinity and transport a broad range of amino acids, whereas VfAAP1 showed a preference for cysteine and VfAAP3 for lysine and arginine. VfOPT1 functionally complemented the mutation in a peptide transporter gene of a mutant yeast strain by promoting growth in a medium supplemented with the di-peptide His-Ala. Specific expression profiles were seen for the AAPs and OPTs. VfAAP1 was highly expressed in cotyledons at early developmental stages and moderately in gynoecia. Its peak of expression in cotyledons corresponded to the appearance of storage protein transcripts, suggesting that this transporter fulfills an important role in providing amino acids to build up storage proteins, whereas VfAAP3 was expressed ubiquitously in maternal tissues and seemed to have a 'house-keeping' role. Expression of the OPTs in late cotyledon development may be correlated to periods of intensive proteolysis due to leaf senescence. In situ hybridization showed that VfAAP1 mRNA is distributed throughout the cotyledon parenchyma, but not in the epidermal cell layer. VfOPT1 transcripts were localized only in the epidermal cell layer of the cotyledons. Data showed that VfAAP1 is down regulated in the presence of amino acids, as opposed to storage protein genes, which were up-regulated by amino acids. Seeds from transgenic V. narbonensis plants overexpressing the VfAAP1 cDNA under control of the LegB4 promoter had altered contents of nitrogen, proteins, sulfur and starch, implicating that this permease can affect, at least to some extent, the accumulation of storage products in the seeds.