Charakterisierung des Triggerfaktors - einer ribosomenassoziierten Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase aus Escherichia coli

Abstract

PPIasen sind in der Lage, die cis/trans-Isomerisierung von -Xaa-Pro-Peptidbindungen zu katalysieren. Entsprechend ihrer spezifischen Funktion gibt es verschiedene Vertreter dieser Enzymklasse in nahezu allen zellulären Kompartimenten. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Identifizierung des E. coli Triggerfaktors als ribosomenassoziierte PPIase. Diese subzelluläre Lokalisation ist bisher einzigartig unter den bekannten PPIasen und läßt eine Funktion als Katalysator der Proteinbiogenese vermuten. Die ribosomale Assoziation des Triggerfaktors ist dabei nicht nur auf translatierende Ribosomen bzw. RNC beschränkt, sondern kann auch mit isolierten 50S Untereinheiten bzw. reassoziierten 70S Ribosomen beobachtet werden. Dabei scheint die Bindung von Triggerfaktor an die ribosomalen Partikel einer 1:1 Stöchiometrie zu folgen. Untersuchungen zur LiCl-vermittelten Dissoziation von 50S Untereinheiten sowie die fehlende PPIase-Aktivität in Fraktionen der "tightly coupled" Ribosomen eines Triggerfaktor-defizienten E. coli Stammes lassen vermuten, daß Triggerfaktor die einzige PPIase am isolierten E. coli Ribosom ist. Triggerfaktor konnte bis zur Homogenität aus E. coli Zellen gereinigt werden. Die katalytischen Eigenschaften des gereinigten authentischen und des rekombinanten Proteins sind identisch und ähneln hinsichtlich des Substraterkennungsmusters denen der FKBP. Die PPIase-Aktivität des Triggerfaktors ließ sich jedoch nicht durch mikromolare Konzentrationen von FK506 oder CsA inhibieren. Im Gegensatz zum hFKBP12 ist die katalytische Effizienz des Triggerfaktors in der durch Prolylisomerisierung limitierten Rückfaltung der RCM-T1 außergewöhnlich hoch. Triggerfaktor ist ein modulares Protein. Durch limitierte Proteolyse des Triggerfaktors konnte der zentrale Sequenzbereich (Arg145-Glu251) als PPIase-aktive Domäne identifiziert werden. Diese Domäne erhält die katalytischen Eigenschaften des intakten Triggerfaktors gegenüber Tetrapeptidsubstraten. Für die hohe Effizienz bei der Katalyse der Proteinfaltung ist die intakte Form des Triggerfaktors notwendig. Die Aminosäuresequenz der PPIase-aktiven Domäne des Triggerfaktors teilt einen gewissen Grad an Sequenzhomologie mit der PPIase-Familie der FKBP. In einer vergleichenden Untersuchung wurden die durch ortsspezifische Mutagenese erzeugten Varianten der Triggerfaktor-PPIase-Domäne und des hFKBP12 hinsichtlich ihrer katalytischen Eigenschaften im proteasegekoppelten Aktivitätstest untersucht. Darüber hinaus konnte durch Anwendung von verschiedenen Domänenvarianten des Triggerfaktors (TF1-145, TF1-251, TF145-251 und TF145-432) in Ribosomenbindungs-experimenten gezeigt werden, daß die ribosomale Assoziation des Triggerfaktors durch die N-terminale Domäne (TF1-145) vermittelt wird.

PPIases are able to catalyze the cis/trans isomerization of peptidyl-prolyl bonds in small peptides and proteins. According to their specific function there are several types of PPIases with different cellular distribution. In this work the identification of the E. coli trigger factor as a ribosome associated PPIase is described. This localization is unique among all known PPIases and it could be assumed that trigger factor may play a role as a catalyst of de novo protein folding at the ribosome. For the interaction of trigger factor with the 70S ribosome and also with isolated 50S subunits a binding stoichiometry of 1:1 was shown. There was no PPIase activity detected on tightly coupled ribosomes isolated from a trigger factor deficient strain. Trigger factor was isolated from E. coli extract to apparent homogeneity. The purified protein as well as a recombinant form were comparable in their PPIase activity towards tetrapeptide-4-nitroanilides as substrates and exhibit a subsite specificity which is reminiscent of FKBP. However, the PPIase activity of trigger factor could not be inhibited by micromolar concentrations of FK506 despite sharing sequence homology with FKBPs. The catalytic efficiency of trigger factor towards a refolding protein substrate limited in rate by a single trans to cis isomerization was extremely high in comparison to other PPIases. The 48 kDa trigger factor is composed of at least three domains. Following limited proteolysis the central and PPIase-active domain encompassing Arg145-Glu251 of the entire protein was isolated. This FKBP-related domain retains the catalytic activity of the full length trigger factor towards tetrapeptide derivatives but not towards a refolding polypeptide substrate. Further analysis was done by comparison of the catalytic properties of several point mutated protein variants and the corresponding hFKBP12 variants. Besides, certain domain constructs of trigger factor were purified from overexpressing cultures. From the corresponding domains TF1-145, TF1-251, TF145-251 and TF145-432 , respectively, only TF1-145 and TF1-251 were able to bind to ribosomes indicating that the N-terminal domain of trigger factor targets the protein to the ribosome.