Untersuchung der Expression und Induzierbarkeit der Cytochrom P450 -Isoformen 2E1, 1A1 und 2B in der Rattenlunge

Abstract

Die Rolle der inhalativen und systemischen Belastung mit Kanzerogenen des Zigarettenrauches in der Genese des Lungenkarzinoms ist heute unbestritten. Hierbei wesentliche Kanzerogene sind u.a. die Nitrosamine und polyzyklische Kohlenwasserstoffe, wie das Benzo(a)pyren. Diese entwickeln ihre toxische Wirkung z.T. erst durch Cytochrom P450 vermittelte Metabolisierung. Das Cytochrom P450-System umfasst eine Reihe verschiedener Isoformen, die sich durch unterschiedliche Substrataffinitäten und –spezifitäten sowie ein spezies-, organ- und gewebespezifisches Verteilungsmuster auszeichnen. So werden die Nitrosamine durch die CYP2E1 Isoform und das Benzo(a)pyren durch die Isoformen CYP1A1 und CYP2B metabolisiert. Ziel dieser Arbeit war es, die pulmonale Expression der Isoformen CYP2E1, 2B und 1A1 sowie ihre Veränderlichkeit am Tiermodell der Wistar-Ratte zu untersuchen. Dazu wurden in vitro Versuchsreihen an primären Alveolar Typ II-Zellkulturen sowie Ganztierversuche vorgenommen, das Modell der Isoliert Perfundierten Lunge wurde auf die Anwendbarkeit für metabolische Untersuchungen der Isoformen geprüft. Die Alveolar Typ II-Zellen sind deshalb von besonderem Interesse, da sich aus ihnen das bronchiolo-alveoläre Adenokarzinom der Lunge ableitet. Der prozentuale Anteil dieser Karzinomform an der Gesamtzahl der Lungenkrebsfälle hat seit zunehmendem Gebrauch von Filterzigaretten im Verlauf der letzten Jahre stetig zugenommen. Als ursächlich werden hierfür die Nitrosamine angesehen. Die Enzymexpressionen wurden unter Verwendung der Western- und Northern-Blot-Analytik untersucht. Für die Untersuchung des CYP2E1 in der Alveolar Typ II-Zellkultur wurde das Modell des Bioassays mittels Chlorzoxazonhydroxylierung erstmals an einer Primärzellkultur angewandt. Im Rahmen der Induktionsversuche ließ sich in den Alveolar Typ II-Zellen durch Ciprofibrat und Permethrin keine Induktion des CYP2B nachweisen. Für beide Substanzen war aus der Literatur ein induktiver Effekt auf die CYP2B Expression in Rattenhepatozyten bekannt. Die CYP2E1 Proteinexpression war nach in vitro Behandlung mit Ciprofibrat der Alveolar Typ II-Zellen herabgesetzt, auch hier war aus der Literatur eine Induktion in Rattenhepatozyten beschrieben worden. Die Induktionsversuche wurden zu Vergleichszwecken parallel auch an primären Rattenhepatozyten vorgenommen, dabei fanden sich jeweils erhöhte CYP2B und 2E1 Proteinexpressionen. Im Ganztierversuch wurden Wistar-Ratten in therapeutischen Dosen mit Ciprofibrat vorbehandelt und im Anschluss Lungen- und Lebergewebe hinsichtlich der CYP2E1 Proteinexpression untersucht, diese war im Lungengewebe im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle erniedrigt und im Lebergewebe erhöht.

Today there is no doubt any more about the role of the inhalative and systemic burden of cancerogenes in cigarette smoke in the genesis of lung cancer. Herein crucial cancerogens are the nitrosamines and polycyclic hydrocarbons as benzo(a)pyrene. They develop their toxic potential partially only via cytochrome P450 dependent metabolism. The cytochrome P450 system contains a variety of isoformes which differ in their substrate affinity and specifity as well as in their distribution among the different species, organs and tissues. The nitrosamines are metabolised for instance by the CYP 2E1 isoforme and benzo(a)pyrene by the isoformes CYP1A1 and 2B. It was the aim of this dissertation to investigate the expression of the CYP isoformes 2E1, 1A1 and 2B in lung tissue and their variability by using the model of Wistar rats. For that reason, experiments were undertaken by usage of primary alveolar type II cell cultures systems as well as in vivo experiments, the model of the Isolated Perfused Lung was studied concerning its practicability for metabolic investigations of the different isoformes. The alveolar type II cells are of special interest because the bronchiolo-alveolar adenocarcinoma of the lung derives from that cell type. The percentage of this cancer among all lung cancers is rising with the spreading use of filtered cigarettes. The nitrosamines are regarded as being crucial for this. The Western and Northern blot analysis were used to measure the expression of the enzymes. The model of a bioassay which functions by hydroxylation of chlorzoxazone was used in primary cell culture system for the first time in order to investigate the CYP 2E1 in alveolar type II cells. There was no inductive effect to be seen neither for ciprofibrate nor for permethrine on the expression of CYP 2B in alveolar type II cells. Such an inductive effect of both substrates was known before in literature on the expression of CYP 2B in rat hepatocytes. The CYP 2E1 protein expression in alveaolar type II cells was diminished by in vitro treatment of the cells with ciprofibrate although here was known in literature an induction in hepatocytes as well. To compare, these experiments were undertaken on primary rat hepatocyte cell cultures at the same time. Herein the levels of CYP 2B and 2E1 protein expressions were increased as described before. Further Wistar rats were treated in vivo with ciprofibrate in therapeutic dosages. Afterwards the CYP 2E1 protein expression in the lung and liver was analysed. This was diminished in the lung and increased in the liver in comparison to the respective control.