Identifizierung eines am Steroid- und Tetrapyrroltransport beteiligten Proteins in Pflanzen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals ein pflanzliches PBR-homologes Protein charakterisiert. Es sind zahlreiche pflanzliche PBR-homologen Sequenzen bekannt. Das Vorkommen dieses Proteins ist nicht beschränkt auf die in dieser Arbeit untersuchten Pflanzen Digitalis lanata und Arabidopsis thaliana, sondern umfaßt Vertreter von niederen Pflanzen wie Rotalgen, Moose und die hochentwickelten Dikotyledonen-Pflanzenfamilien. Aufnahmestudien an Blättern, isolierten Mitochondrien und E. coli-Zellen mit dem rekombinant exprimierten pflanzlichen PBR-homologen Protein zeigten, daß Cholesterol ligandenabhängig in die Mitochondrien aufgenommen wird. Protoporphyrin IX wird von isolierten Mitochondrien und dem rekombinant exprimierten Protein ligandenabhängig aufgenommen. Als beeinflußende Liganden wurden Ro5-4864, PK 11195, Flunitrazepam und Protoporphyrin IX eingesetzt. Durch Bindungsstudien wurde gezeigt, daß das pflanzliche PBR-homologe Protein spezifische Bindung zu Ro5-4864 und PK 11195 aufweist. Es wurden verschiedene Deletionsmutanten hergestellt, um die Funktion einzelner Domänen des pflanzlichen PBR-homologen Proteins zu untersuchen. Für das pflanzliche PBR-homologe Protein werden fünf Transmembrandomänen vorhergesagt. Diese Transmembranhelices sind denen für ein tierisches PBR homolog und könnten ebenfalls eine kanalähnliche Struktur bilden, die eine Funktion als Transportprotein charakterisieren würde. Mit Hilfe des Two-Hybrid-Systems und anschließendem GST-Pull-Down-Assay wurden Interaktionspartner des pflanzlichen PBR-homologen Proteins identifiziert. Eine Interaktion erfolgte mit einem putativen Membranprotein (Protein I), die andere mit einem Protein unbekannter Funktion (Protein II). Aufgrund der Homologien des putativen Membranproteins zu einer Familie von Proteinen, die als Proteinträger am intrazellularen Transport beteiligt sind und der Analysen des Proteins II, die zu den Annahmen führen, daß das Protein II regulatorische Funktionen aufweist, könnte man eine Einbindung des pflanzlichen PBR-homologen Proteins in Regulationsprozesse der Zelle postulieren, die durch zukünftige Arbeiten aufzuklären sind.

In the work presented, a phytogenic PBR-homologue protein is characterized for the first time. There are several known phytogenic PBR-homologue sequences. The occurance of this protein is not restricted to the plants considered in this treatise (Digitalis lanata and Arabidopsis thaliana), but includes representatives of plants like dulses and mosses as well as the highly developed family of Dicotyledonae. Studies in absorption of recombined exprimated phytogenic PBR-homologue protein performed on leaves, isolated mitochondriae and E. coli bacteria showed that the uptake of cholesterol into the mitochondriae depends on the presence of a ligand. Protoporphyrin IX is transported inside by isolated mitochondriae and the recombined exprimated protein depending on the ligand, as ligands with certain activity Ro5-4864, PK 11195, Flunitrazepam and Protoporphyrin IX were used. Experiments with the bonding characteristics of the phytogenic PBR homologue protein showed that there is specificity in the bonds with Ro5-4864 und PK 11195. Several deletionmutants were made in order to find out more about the functions of individual domains of the phytogenic PBR homologue protein. For the phytogenic PBR homologue protein five transmembrane domains are predicted. These transmembrane helices are homologue to the PBR derived from animals and might form a channel like structure, the function of which is characteristic for protein transport. Molecules interacting with the phytogenic PBR homologue protein were identified by means of the Two-Hybrid-System and subsequent GST-Pull-Down-Assay. One interaction could be shown with a putative membrane protein (Protein I), a second with a protein of unknown function (Protein II). Because of the homologue sequences between Protein I and a group of proteins known to participate in the intracellular transport of proteins, and analyses of Protein II, which lead to the assumption that Protein II has regulatory functions, one could postulate that the phytogenic PBR homologue protein is involved in the cells‘ internal regulatory process, which deserves further study.