Contributions to betalain biochemistry - new structures, condensation reactions, and vacuolar transport

Abstract

Betalaine (rotviolette Betacyane und gelbe Betaxanthine) sind wasserlösliche stickstoffhaltige Farbstoffe von chemotaxonomischer Bedeutung. Das Ziel der Arbeit war die Klärung der Frage, ob der letzte Schritt der Betalainbiosynthese, die Kondensation der Betalaminsäure mit Aminosäuren/Aminen (die Aldiminbildung), eine enzymatisch katalysierte oder eine spontan ablaufende Reaktion ist. Als experimentelle Systeme dienten Betalain-bildende Hairy-Root-Kulturen der Gelben Rübe und Hypokotyle der Futterrübe (Beta vulgaris). Auf Grund des Vorkommens spezifischer Betaxanthinmuster in Pflanzen lag die Vermutung nahe, dass die Kondensationsreaktion ein Enzym-katalysierter Vorgang sein könnte. Mittels photometrischer und HPLC-Enzymassays nach verschiedenen Proteinextraktionsverfahren konnte in vitro der Nachweis einer protein-katalysierten Kondensation zwischen Betalaminsäure und Aminosäuren nicht erbracht werden. Um die Betaxanthinbildung in vivo zu analysieren, wurden verschiedene Aminosäuren an Hairy-Root-Kulturen und an Hypokotyle von Futterrüben appliziert, die zur Bildung der entsprechenden abgeleiteten Betaxanthine führte. Die Daten belegen, dass die Betaxanthinbildungsreaktion weder eine Aminosäurespezifität noch eine Stereoselektivität zeigt. Alle experimentellen Daten zusammengenommen weisen daraufhin, dass die Kondensation der Betalaminsäure mit Aminosäuren/Aminen (einschließlich cyclo-Dopa) in planta sehr wahrscheinlich eine spontane, und nicht eine Enzym-katalysierte Reaktion ist. Um auf die Fragen weiter einzugehen, wie die Betaxanthin-bildenden Pflanzen es erreichen, ein spezifisches Muster an Betaxanthinen trotz der spontanen Bildungsreaktion zu akkumulieren, und in welchem Kompartiment die Aldiminbildung abläuft, wurde der Transport von Präkursoren und Endprodukten der Betalainbiosynthese in Vakuolen Roter Beete untersucht. Aufgrund der großen Schwankungen der Transportdaten müssen die Ergebnisse mit Vorbehalt diskutiert werden. Dennoch kannist aus den Daten der vakuolären Betaxanthintransportes, die bei Verwendung verschiedener Inhibitoren erhalten wurden, folgender Trend diskutiert werdenerkennbar: die Hemmung des MgATP-stimulierten Transportes der Rüben-spezifischen Betaxanthine Miraxanthin V (Dopamin-Betaxanthin) und Vulgaxanthin I in die Vakuolen durch Vanadat weist auf die Beteiligung eines direkt-energisierten ABC-Transporters hin, während die Hemmung der Aufnahme des unnatürlichen (R)-Phe-Betaxanthins durch Bafilomycin A1 und NH4Cl mit einem H+/Antiport-System kompatibel ist. Um das experimentelle System umfassend zu charakterisieren, wurden die Betalainmuster der transgenen Hairy-Roots der Gelben Rübe während des Wachstums analysiert und seine Komponenten strukturell aufgeklärt. Neben den bereits bekannten Verbindungen Betanin, Betalaminsäure und Miraxanthin V konnten die Dopamin-abgeleiteten Betacyane (2-Descarboxy-betanidin, sein 5-O-glucosid und das entsprechende 6'-O-Malonylkonjugat) erstmalig identifiziert und damit ein neuer Zweig der Betalainbiosynthese nachgewiesen werden.

Betalains are water-soluble nitrogen-containing pigments of chemotaxonomic importance, which comprise the red-violet betacyanins and the yellow betaxanthins. The aim of the presented work was to determine wheather the last biosynthetic step in betalain biosynthesis, the condensation between betalamic acid and amino acids/amines, is an enzymic or a spontaneous reaction. As experimental systems betalain-forming hairy root cultures of yellow beets and hypocotyls of fodder beets (Beta vulgaris) were used. Due to the occurrence of specific betaxanthin patterns in plants, the condensation reaction was assumed to be enzyme-catalyzed. Assays designed to detect in vitro a protein-catalysed condensation between betalamic acid and amino acids failed. To analyse the betaxanthin formation feeding of different amino acids to hairy root cultures and hypocotyls of fodder beets was carried out, which led to the formation of the corresponding betaxanthins. The results show that the betaxanthin formation reaction exhibits neither an amino acid specificity nor a stereoselectivity. All experimental results together indicate that the condensation of betalamic acid with amino acid/amines (including cyclo-dDopa) is most likely in planta a spontaneous rather than an enzyme-catalyzed reaction. To deal with the questions how betaxanthin-forming plants achieve the accumulation of specific betaxanthin patterns, most likely irrespectively of the pattern of amino acids in these plants, the transport of precursors and end products of betalain biosynthesis into red beet vacuoles was studied. Due to In spite of the large deviations afterof the uptake data, therefore the results mustcan only be cautiously interpreted, but at least a trend in the experiments to impair the vacuolar betaxanthin uptake by inhibitors can be seen: the inhibition of the MgATP-stimulated uptake of the beet-specific miraxanthin V and vulgaxanthin I by vanadate points to the participation of an ABC-like directly-energized transport mechanism, whereas the uptake inhibition of the unnatural (R)-Phe-betaxanthin by bafilomycin A1 and NH4Cl is compatible with a H+/antiport system. For the characterization of the biosynthetic capacity of the transgenic hairy roots of yellow beets, the betalain pattern was analysed and structurally elucidated. Besides the already known betanin, betalamic acid and miraxanthin V (dopamine-betaxanthin), the dopamine-derived betacyanins (2-descarboxy-betanidin, its 5-O-glucoside and the corresponding 6'-O-malonyl conjugate) have been identified for the first time and a pathway of biosynthesis of these betacyanins was proposed.