Mitogen-aktivierte Proteinkinasen - neue Signalelemente in der pflanzlichen Pathogenabwehr

Abstract

Die vorgestellte Arbeit zeigt zum ersten Mal die rezeptorvermittelte Aktivierung pflanzlicher MAPKs (Mitogen-aktivierte Proteinkinasen). Nach Bindung eines Elicitorpeptids an einen Rezeptor der Plasmamembran von Petersiliezellen werden über einen weitgehend unbekannten Signalweg drei verschiedene MAPKs (40, 44 und 46 kDa) aktiviert. Die Aktivierung der MAPKs erfolgt durch Phosphorylierung des konservierten TEY-Motivs auf der MAPK-Aktivierungsschleife. In In-Gel-MBP-Kinasenachweisen zeigte die elicitorresponsive 40-kDa-MAPK deutliche Unterschiede zu der 44- und der 46-kDa-MAPK und gehört möglicherweise einer bisher nicht bekannten Unterfamilie pflanzlicher MAPKs an. Es wurde gezeigt, daß elicitorstimulierte Ionenströme über die Plasmamembran hinreichend und notwendig für die Aktivierung der elicitorresponsiven MAPKs sind. Der "oxidative burst", der ebenfalls eine wichtige Signalkomponente in der Petersilie-Elicitorantwort darstellt, liegt dahingegen unterhalb der MAPK-Induktion oder in einem parallelen Signalweg. Es konnten 5 verschiedene Petersilie-MAPK-cDNAs aus 3 unterschiedlichen Untergruppen kloniert werden (MPK1-5), von denen vier funktionell in Bakterien exprimiert wurden. Durch die Verwendung von Peptiden aus heterologen Sequenzbereichen konnten trotz der hohen Homologie der klonierten Pertersilie-MAPKs Antiseren gewonnen werden, die spezifisch zwischen den verschiedenen Untergruppen diskriminieren. Mit ihnen und mit Seren gegen Medicago-MAPKs wurden die elicitorresponsiven MAPKs immunologisch charakterisiert. Dabei konnte nachgewiesen werden, daß die größte der elicitorresponsiven MAPKs (46 kDa) identisch mit MPK3 ist und daß MPK1, 4 und 5 nicht elicitorresponsiv sind. Durch Immunlokalisierungsstudien wurde demonstriert, daß MPK3 nach Elicitierung im Zellkern akkumuliert. Dieser schnelle elicitorstimulierte Kerntransport läßt vermuten, daß MPK3 unmittelbar an der Regulation von Transkriptionsfaktoren beteiligt ist, die die Transkription elicitorresponsiver Gene aktivieren. Um diese Hypothese zu verifizieren, wurde ein Protoplasten-Kotransformationsexperiment etabliert, mit dem die Beteiligung der MAPKs an der transkriptionellen Regulation elicitorresponsiver Gene analysiert werden konnte. Dieses System erlaubte es, den Einfluß der Überexpression aktiver und inaktiver Varianten der MAPKs auf die Expression eines Reportergens zu untersuchen, dessen Transkription durch ein elicitorresponsives Promotorfragment des Petersilie-PR1.1- bzw. -PR2-Gens reguliert wurde. Mit Hilfe der Kotransformationen konnten Hinweise gewonnen werden, daß MPK3 und eine Kinase aus der MPK1/2-Gruppe an der elicitorstimulierten Aktivierung der Transkription des PR1.1- und des PR2-Gens beteiligt sind. MPK4 scheint dahingegen nicht in die Regulation dieser Gene involviert zu sein. Um Regulatoren und Substrate der elicitorresponsiven MAPKs in Petersilie zu isolieren, wurde unter Verwendung von Poly(A)+-RNA aus elicitierten und nicht-elicitierten Petersiliezellen eine cDNA-Bank für das Hefe-Zwei-Hybrid-System konstruiert. Diese Bank wurde mit MPK1 durchsucht, wobei zwei potentielle Interaktionspartner dieser MAPK identifiziert werden konnten.

Plants apparently recognize potentially pathogenic organisms through receptors that specifically bind pathogen or plant-derived signal molecules, so-called elicitors, and thereby initiate signaling cascades activating a multicomponent defense response. Cultured parsley cells and the oligopeptide elicitor, Pep13, derived from a hyphal cell wall glycoprotein of the plant pathogenic oomycete, Phythophtora sojae, are the experimental system we use to investigate the molecular mechanisms underlying recognition and signaling events in this process. Pep-13 is perceived by the plant cell through a plasma membrane receptor and thereby stimulates a complex defense response in cultured parsley cells very similar to the response of intact plants to infection with this fungus. Early elements of the plant response are ion fluxes across the plasma membrane and the production of reactive oxygen species, the oxidative burst, followed by defense gene activation and phytoalexin accumulation. Recently we found three MAP kinases to be activated by phosphorylation in a receptor dependent manner very rapidly and transiently after elicitation. At least one of these relocate to the nucleus upon stimulation and may there be implicated in the regulation of transcription-factors controlling defense gene expression. By loss and gain of function experiments the MAP kinase activation could be located downstream of the elicitor-stimulated ion fluxes but upstream or independent of the oxidative burst. Five different MAP kinases from parsley were cloned and antibodies specifically recognizing the different parsley MAP kinase isoforms were produced. By using these antibodies and antibodies against Medicago sativa MAP kinases we could show that only one of these five parsley MAP kinases is elicitor-responsive and that this elicitor-responsive MAP kinase (MPK3) is a homologue of the salicylate-inducible MAP kinase from tobacco. In a protoplast cotransformation assay the effect of the overexpression of active and inactive MAPK-constructs on the activation of elicitor-responsive promoters was tested. The experiments give good evidence that MPK3 and a kinase of the MPK1/2 group are involved in the transcriptional regulation of defense genes.