Skip navigation
Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.25673/3532
Title: Walk Through Rekombination - Entwicklung einer neuen Methode zur homologen in vitro Rekombination und Optimierung des diagnostischen Enzyms Creatinase
Author(s): Kenklies, Janet
Granting Institution: Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
Issue Date: 2004
Extent: Online-Ressource, Text + Image
Type: Hochschulschrift
Language: German
Publisher: Universitäts- und Landesbibliothek Sachsen-Anhalt
URN: urn:nbn:de:gbv:3-000007606
Subjects: Elektronische Publikation
Zsfassung in engl. Sprache
Abstract: Der Inhalt dieser Arbeit beschäftigt sich mit der Optimierung diagnostischer Enzyme mit Methoden des evolutionären Proteindesign. Im ersten Teil wird eine neue Methode der homologen in vitro Rekombination vorgestellt, welche aus fünf Schritten besteht: (1) Synthese Uracil-DNA-haltiger DNA (U-DNA) von den Elterngen-Sequenzen, (2) Synthese von DNA-Fragmenten mittels einer Kettenabbruchreaktion mit Didesoxynukleotiden und mit U-DNA als Template, (3) Abbau der Template-U-DNA, (4) Reinigung der DNA-Fragmente und (5) Reassemblierung der Fragmente mit gleichzeitigem Abbau der terminierenden Didesoxynukleotide. Die Funktionsfähigkeit der entwickelten Methode wurde durch Rekombination von zwei Genen der Alkalischen Phosphatase und anschließende Sequenzdatenanalyse überprüft. Der zweite Teil dieser Arbeit beschreibt die Erhöhung der thermischen Stabilität der Creatinase aus Erwinia sp. unter Beibehaltung der katalytischen Effizienz. Diese Optimierung umfasste zwei Zyklen fehlerhafter PCR mit anschließendem Screening auf thermische Stabilität und auf Enzymaktivität bei Substratlimitation. Anschließend wurden die Aminosäuren an den identifizierten Positionen permutiert. Die finale Mutante CTsd7 unterschied sich in ihrem apparenten Schmelzpunkt um 8 °C vom Wildtyp.
This thesis is about the optimisation of diagnostic enzymes using methods of evolutionary protein design. The first part describes the development of a new method for homologous in vitro recombination, which consists of the following five steps: (1) synthesis of uracil containing DNA from the parental sequences, (2) synthesis of DNA fragments using the principle of the Sanger sequencing method with didesoxynucleotides and with uracil containing DNA as template, (3) digestion of uracil containing template DNA, (4) purification of DNA fragments and (5) reassembly of fragments and simultaneous digestion of terminating didesoxynucleotides. The efficiency of this method has been proved by recombination of two alkaline phosphatase genes and subsequent sequence analysis. The second part describes the optimisation of creatinase from Erwinia sp. in order to achieve an increased thermal stability while catalytic efficiency had to be kept constant. This optimisation has been done by two cycles of mutagenic PCR and subsequent screening of enzyme libraries for thermal stability and for enzyme activity at limitating substrate concentrations. Positions of beneficial identified amino acids have been afterwards permutated. The apparent melting point of the final mutant CTsd7 is 8 °C increased compared to the wild type.
URI: https://opendata.uni-halle.de//handle/1981185920/10317
http://dx.doi.org/10.25673/3532
Open access: Open access publication
Appears in Collections:Hochschulschriften bis zum 31.03.2009

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
prom.pdf1.95 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open
Show full item record BibTeX EndNote


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.