Entwicklung eines Verfahrens zur Identifizierung von toxikologischen Leitsubstanzen in komplexen Stoffgemischen und deren gentoxische Wirkungen in Säugerzellkultursystemen

Abstract

Menschen sind in ihrer gesamten Umgebung vielfältigen chemisch komplex zusammengesetzten Stoffgemischen ausgesetzt. In dieser Arbeit wurden am Beispiel eines komplexen Stoffgemisches, welches als Abprodukt beim Plasmaätzen in der Halbleiterindustrie entsteht und aus ca. 80 halogenierten Kohlenwasserstoffen besteht, die toxikologischen Leitsubstanzen ermittelt und alle in der Arbeit eingesetzten Testsysteme zur Erfassung gentoxischer Wirkungen bezüglich ihrer Anwendbarkeit auf komplex zusammengesetzte chemische Gemische positiv validiert. Während der in vitro-Charakterisierung durch Gentoxizitätstestung (alkalischer und neutraler Comet Assay, DNA-Reparaturstudien, in vitro-Mikrokerntest, Test zur Koloniebildungsfähigkeit und Genmutationstests) konnten wichtige Informationen zur DNA-Schädigung und dem mutagenen Potential des komplexen Stoffgemisches in primären Rattenhepatozyten, humanen Lymphozyten, humanen Bronchialepithelzellen und in Tumorzelllinien gewonnen werden. Das komplexe Stoffgemisch löste konzentrationsabhängig DNA-Einzel- und Doppelstrangbrüche und AP-Stellen und Chromosomenaberrationen aus. Die direkte gentoxische Wirkung wurde durch den Zusatz des extrametabolisierenden Systems S9-Mix bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass das komplexe Stoffgemisch über ein erhebliches mutagenes Potential verfügt. Die Stoffe Hexachlorbutadien, Octachlorcyclopenten und Pentachlorbenzol gehören zu den toxikologischen Leitsubstanzen. Durch die Optimierung eines Protokolls zur Kryokonservierung von Schweinehepatozyten ist es gelungen, ein weiteres, aufgrund seiner metabolischen Kapazität besonders geeignetes Primärzellkultursystem für gentoxikologische Tests von komplexen Stoffgemischen zu etablieren.

Most occupational and environmental chemical exposure are to mixtures, not single agents. The focus of interest is the genotoxicological characterisation of a complex mixture of mostly perhalogenated hydrocarbons which is generated as a waste product from the plasma etching process in the semiconductor industry. By use of several in vitro test systems (alkaline and neutral comet assay, micronucleus test, DNA repair studies, genmutationassay and colony forming assay), the clastogenic as well as the mutagenic potency of the mixture was tested in various human cell types (lymphocytes and normal bronchial epithelial cells), in rat hepatocytes, and in various tumor cell lines. Results demonstrated that the complex mixture causes DNA single and double strand breaks, AP sites, and micronuclei formation. The direct genotoxic potency was proved by use of the external metabolising system S9 mix. It could be shown that the complex mixture possess high mutagenic potency. Hexachlorbutadien, Octachlorcyclopenten and Pentachlorbenzol are some of the toxicological key compounds. By optimising the process of cryopreservation of porcine hepatocytes, we were able to establish a very appropriate primary cell culture system for genotoxicological characterisation of complex mixtures.