Carnitin-Palmityltransferase und Carnitin-Oktanyltransferase - Substratspezifität der Carnitin-Acyltransferasen im nativen menschlichen Skelettmuskelhomogenat und nach Trennung durch Ultrazentrifugation

Abstract

Im menschlichen Skelettmuskel wird der Transport von Fettsäureestern zwischen den Kompartimenten und dem Zytoplasma durch verschiedene Carnitin-Acyltransferasen katalysiert. Im Mittelpunkt des Transports von langkettigen Fettsäureestern steht die Carnitin-Palmityltransferase, die auf Grund ihrer Spezifität für Palmityl-CoA diesen Namen erhielt. Des weiteren existiert eine Carnitin-Oktanyltransferase, die den Transfer von mittellangkettigen Fettsäuren durch die Peroxisomen und Mikrosomen katalysiert. Wird die Aktivität der Acyltransferasen am menschlichen Skelettmuskel in vivo mittels Isotopen-Vorwärts-Reaktion bestimmt, so setzt sich die gemessene enzymatische Aktivität anteilig aus verschiedenen Transferaseaktivitäten zusammen. Ziel dieser Arbeit war die Substratspezifitäten der verschiedenen Carnitin-Acyltransferasen des Skelettmuskels in vivo zu beschreiben und herauszufinden inwieweit sich die Aktivitäten der Transferasen überlappen. Die Versuchsbedingungen entsprachen denen, in der diagnostischen Praxis der Bestimmung des CPT II-Mangels gegebenen, um die erhaltenen Ergebnisse in Verbesserungen der Diagnostik einfließen zu lassen. Es sollte das Substrat mit der größten Spezifität für die beiden Transferasen (CPT und COT) bestimmt werden, da nach einer Arbeit von Schaefer et al. die CPT die größte enzymatische Aktivität für Lauryl-CoA (12 C-Atome) besitzen soll [85]. Die Sensitivität der Acyltransferasen für eine Inhibition durch Malonyl-CoA sollte untersucht werden, um herauszufinden welcher Anteil der Hemmung durch die CPT I beziehungsweise durch die COT ausgemacht wird. Es konnte gezeigt werden, dass sich die Substratspezifitäten der COT und der CPT für Fettsäureester mit einer Kettelänge von 8-18 Kohlenstoffatomen überlappen, sodass bei der Bestimmung der Carnitin-Acyltransferase-Aktivität am gesamten Muskelhomogenat immer beide Enzyme gemessen werden. In allen untersuchten Fraktionen zeigten die Transferasen die größte Affinität zum Substrat Palmityl-CoA. Der Anteil der CPT an der Gesamtaktivität überwiegt den der COT für dieses Substrat bei Weitem, sodass es nicht unbedingt nötig ist, die COT vor der Bestimmung abzutrennen. Sowohl die CPT als auch die COT zeigten für das Substrat Lauryl-CoA die geringste Affinität und schlechteste katalytische Effizienz. Die CPT und die COT sind Malonyl-CoA sensitiv, wobei die CPT-Aktivität um 45% gehemmt wird, während die COT-Aktivität nur zu circa 20 % hemmbar ist. Die Ergebnisse unterstützen die bisherige Annahme, dass die CPT den Fettsäureester Palmityl-CoA spezifisch umsetzt und dieser zur Untersuchung von CPT-Defekten in Patientenmuskel das Substrat der ersten Wahl ist.

In human skeletal muscle the transport of fatty acids between compartiments and cytoplasm is catalized by different carnitine acyltransferases. Carnitine palmitoyl transferase, which shows specificity for palmitoyl-CoA, is most important in the transfer of long chain fatty acids. Furthermore a carnitine octanoyl transferase exists, catalyzing the transfere of medium/long chain fatty acids across peroxisomes and microsomes. Measuring the activity of acyl transferases in human skeletal muscle in vivo by isotope forward assay, whole activity is determined by different transferase activities. Aim of this study was to describe the substrate specificities of the different carnitine acyl transferases of skeletal muscle in vivo and to investigate overlapping effects between the transferases. The experimental conditiones were equal to those, used in neurological diagnostic of CPT deficiency , so that the results may improve diagnostic. Schaefer et al. suggested highest enzymatic activity with lauroyl-CoA (C12-CoA). In this context substrate with highest specificity to both transferases (CPT and COT) should be determined. Sensitivity to the inhibitor malonyl-CoA was investigated to find out to what extend CPT I and COT were responsible for malonyl-CoA sensitivity. It could be showed that substrate specificities of CPT and COT are overlapping for fatty acids with chain length of 8 - 18 carbon atoms, so determining the activity of carnitin acyl transferases in the whole muscle homogenate, both enzymes are measured. In all fractions the transferases showed highest affinity to substrate palmitoyl-CoA. The part of CPT in whole acitivity for this substrate predominates the part of COT, so it is not nessecary to separate COT before investigation. CPT and COT showed the lowest affinity and catalytic efficiency to lauroyl-CoA. Both, CPT and COT, are sensitive for malonyl-CoA. While 45 % of CPT are inhibited by malonyl-CoA, only 20 % of COT activity are sensitive. These results support the previous view, that CPT has its specificity for palmitoyl-CoA, so this is the optimal substrate for diagnosis of CPT deficiencies in patient muscle.