Extending the CRISPR-Cas9-based imaging toolbox to improve the detection of chromosomal DNA

Abstract

Understanding the spatial organization of genomes within chromatin is key to deciphering gene regulation. The CRISPR–FISH genome labeling tool enables efficient labeling of repetitive sequences without the need for global DNA denaturation, thereby preserving chromatin structure better than traditional FISH. Here, we introduce CRISPR-CID (CRISPR/dCas9-mediated chromogenic in situ detection), a non-fluorescent labeling method that uses biotin-labeled tracrRNA, target-specific crRNA, and dCas9 protein for chromogenic detection, enabling visualization with a bright-field microscope. Furthermore, we present improvements to the CRISPR–FISH method through the engineering of a recombinant dCas9 protein containing an ALFA-tag. By using dCas9 protein with multiple copies of the ALFA-tag, in combination with a minibody and fluorescence-labeled anti-rabbit secondary antibody, we achieved enhanced target-specific labeling. This system also facilitated live-cell imaging of telomeres in Nicotiana benthamiana. Additionally, we successfully integrated tyramide signal amplification with CRISPR–FISH, resulting in highly sensitive labeling of Arabidopsis centromeres. These novel techniques have the potential to expand the CRISPR imaging toolbox in the field of chromosome biology.

Das Verständnis der räumlichen Organisation von Genomen innerhalb des Chromatins ist der Schlüssel zur Entschlüsselung der Genregulation. Das Genom-Markierungswerkzeug CRISPR-FISH ermöglicht eine effiziente Markierung repetitiver Sequenzen, ohne dass eine globale DNA-Denaturierung erforderlich ist, wodurch die Chromatinstruktur besser erhalten bleibt als bei herkömmlicher FISH. Hier stellen wir CRISPR-CID (CRISPR/dCas9-vermittelte chromogene In-situ-Detektion) vor, eine nicht-fluoreszierende Markierungsmethode, die Biotin-markierte tracrRNA, zielspezifische crRNA und dCas9-Protein zur chromogenen Detektion verwendet und die Visualisierung mit einem Hellfeldmikroskop ermöglicht. Darüber hinaus präsentieren wir Verbesserungen der CRISPR-FISH-Methode durch die Entwicklung eines rekombinanten dCas9-Proteins, das einen ALFA-Tag enthält. Durch die Verwendung des dCas9-Proteins mit mehreren Kopien des ALFA-Tags in Kombination mit einem Minikörper und einem fluoreszenzmarkierten sekundären Kaninchen-Antikörper konnten wir eine verbesserte zielspezifische Markierung erreichen. Dieses System ermöglichte auch die Darstellung von Telomeren in lebenden Zellen in Nicotiana benthamiana. Darüber hinaus haben wir die Tyramid-Signalverstärkung erfolgreich in CRISPR-FISH integriert, was zu einer hochempfindlichen Markierung der Zentromere von Arabidopsis führte. Diese neuen Techniken haben das Potenzial, den CRISPR-Werkzeugkasten für die Bildgebung im Bereich der Chromosomenbiologie zu erweitern.