Biochemische Charakterisierung der Glycosyltransferase Dpm1 aus S. cerevisiae und in vitro Dolichylphosphatmannose-Produktion

Abstract

Dolichylphosphat-Mannose (DolPM) ist zentraler Mannosyldonor in vier Glykosylierungswegen in Eukaryoten und kommerziell nicht verfügbar. DolPM wird durch die Dolichylphosphatmannosesynthase 1 (Dpm1) in S. cerevisiae gebildet. In dieser Arbeit wurde eine immobilisierte His6-SUMO-Dpm1-Variante verwendet und in einem kontinuierlichen Prozess 4,2 mg DolPM synthetisiert. DolPM konnte durch MeOH-Präzipitation als auch mit präparativer DC gereinigt und mittels ESI-MS nachgewiesen werden. Die Aktivität des Enzyms konnte erstmals unter Verwendung einer HPLC bestimmt werden. Neben Mg2+ und Mn2+ wurden auch Ni2+, Co2+ und Ca2+, nicht aber Cu2+, als Cofaktoren akzeptiert. Die höchste enzymatische Aktivität wurde bei 35 °C ermittelt (Aktivitätsbereich 20-50 °C). Neben Dolichylphosphat (DolP) wurde auch Phytanylphosphat (PhytP) getestet und beide Lipidsubstrate wurden mit ähnlichen kinetischen Parametern (Vmax, Km) umgesetzt. Die biophysikalische Untersuchung der GDP-Mannose (GDPM) Substratbindung an die His6-SUMO-Dpm1 wurde erstmals mittels ITC untersucht. GDPM wurde mit einem KD von 83 μM von der His6-SUMO-Dpm1 gebunden, wohingegen GDP nicht gebunden wurde.

Dolichylphosphatemannose (DolPM) is the central mannosyl-donor in four glycosylation pathways in eukaryotes. DolPM is synthesized through dolichylphosphatemannose synthase 1 (Dpm1) in S. cerevisiae. Using an immobilized His6-SUMO-Dpm1-variant, 4,2 mg DolPM were continuously synthesized. DolPM was prepared using MeOH precipitation as well as preparative TLC and proved with ESI-MS. The enzyme activity was measured with HPLC. Besides Mg2+ and Mn2+, Ni2+, Co2+ and Ca2+, but not Cu2+, were also accepted as cofactors. The highest enzymatic activity was measured at 35 °C (activity range: 20-50 °C). Natural dolichylphosphate (DolP) as well as artificial phytanylphosphate (PhytP) were tested as lipid substrates. PhytP and DolP had similar kinetic parameters (Vmax, Km). GDP-mannose (GDPM) substrate binding was investigated for the first time biophysically using ITC. GDPM was bound with a KD of 83 μM by His6-SUMO-Dpm1, whereas GDP was not bound.