Entwicklung eines auf nativen Membranen basierenden Untersuchungssystems für das Endoplasmatische Retikulum

Abstract

Das Endoplasmatische Retikulum (ER) erfüllt zahlreiche Funktionen in eukaryotischen Zellen. Da es im Inneren der Zelle liegt und eine komplizierte und dynamische Struktur aufweist, ist es für viele biophysikalische Methoden, die Struktur- und Funktionsinformationen liefern, schwer zugänglich. Giant unilamellar vesicles (GUVs) hingegen sind für mehrere Methoden geeigneter. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die Herstellung von GUVs aus dem ER zu etablieren. Hierzu wurde das Fusionsprotein Sey1p in ER-Membranen von Hefezellen angereichert. Die ER-Membranen wurden isoliert, ihre Reinheit mit Markerprotein-basierten und massenspektrometrischen Methoden analysiert und anschließend GTP-abhängig zu sehr großen Vesikeln fusioniert, den giant ER vesicles (GERVs). Die Anwendbarkeit der GERVs wurde im Rahmen von Immunfluoreszenzfärbungen, Membranproteineinbau, Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie sowie kryo-elektronenmikroskopischen Aufnahmen von verformten Membranen unter Beweis gestellt.

The endoplasmic reticulum (ER) fulfills a multitude of essential functions in eukaryotic cells. However, its intracellular location and intricate and dynamic morphology makes it difficult to apply biophysical methods to the ER to obtain structural and functional information. Giant unilamellar vesicles (GUVs) in contrast constitute a convenient model system for several methods. Hence, the aim of this work was to establish a GUV-shaped model membrane from the native ER. To this end, the fusion protein Sey1p was enriched in yeast ER membranes, which were then isolated and analyzed for purity with a marker-based and a mass-spectrometric approach. The ER membranes were successfully fused to form giant ER vesicles, termed GERVs, in a GTP-dependent way. As proof-of-concept, the use of GERVs for immunostaining, membrane protein incorporation, binding experiments, fluorescence correlation spectroscopy and cryo-electron microscopy of membrane remodelling was demonstrated.