Optimierung von Trypsiligase zur C-terminalen Modifikation von Proteinen

Abstract

Im Arbeitskreis Bordusa konnte Trypsiligase als Biokatalysator für die N- sowie C-terminale Modifikation von Proteinen entwickelt werden. In der vorliegenden Dissertation wurde die Syntheseeffizienz von Trypsiligase im Hinblick auf die C-terminale Modifikation von Proteinen durch ein evolutionäres Enzym-Engineering deutlich verbessert. Hierzu wurde das Phagen-Display als Selektionsverfahren zur effizienten Anreicherung verbesserter Biokatalysatoren basierend auf Trypsiligase optimiert. Mit Hilfe eines eigens entwickelten ELISA-basierten Hochdurchsatz-Screening konnten mehrere Trypsiligase-Varianten identifiziert werden, die eine erhöhte Syntheseeffizienz aufwiesen. Die vielversprechendste Trypsiligase-Variante 2G10 wurde detailliert enzymkinetisch untersucht. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Trypsiligase-Variante 2G10 eine effiziente, schnelle und ortsspezifische Modifikation eines Zielproteins mit einem breiten Spektrum an Funktionalitäten ermöglicht.

In the Bordusa group, trypsiligase was developed as a biocatalyst for the N- and C-terminal modification of proteins. In this work, the synthesis efficiency of trypsiligase with regard to the C-terminal modification of proteins was significantly improved by evolutionary enzyme engineering. For this purpose, phage display was optimized as a selection method for efficient enrichment of improved biocatalysts based on trypsiligase. Using a specially developed ELISA-based high-throughput screening, several trypsiligase variants were identified that showed increased synthesis efficiency. The most promising trypsiligase variant 2G10 was investigated in detail by enzyme kinetics. In addition, trypsiligase variant 2G10 was shown to allow efficient, rapid and site-specific modification of a target protein with a wide range of functionalities.