Hydroxycinnamate glycosyltransferase genes in Brassica napus, encoding key enzymes in sinapate ester metabolism

Abstract

Ziel der Arbeit war es, mögliche Targets für molekulare Züchtungsstrategien zur Verminderung des Sinapatestergehaltes im Samen von Raps (Brassica napus L.) zu identifizieren. Frühere Arbeiten ergaben, dass das Enzym UGT84A9 (BnSGT, Brassica napus UDP-Glucose:Sinapinsäure Glucosyltransferase) ein Schlüsselenzym des Sinapatesterstoffwechsels ist. Ein erster dsRNAi-Ansatz verringerte den Sinapatestergehalt im Rapssamen um 80%. Mehrere Strategien wurden angewandt, um den Sinapatestergehalt weiter zu reduzieren. Bei zwei Transkript-basierten Ansätzen, der Klonierung zweier neuer putativer BnHCA-GTs (Brassica napus Hydroxyzimtsäure-Glycosyltransferase) und einer EST Charakterisierung im Samen, wurde kein weiteres Enzym gefunden, das die Bildung von 1-O-Sinapoylglucose im Rapssamen katalysieren könnte. Eine gleichzeitige Transkriptionsinhibition mittels dsRNAi von UGT84A9 und dem Gen, das für das nachfolgenden Enzym BnSCT1 (1-O-Sinapoylglucose:Cholin-Sinapoyltransferase) kodiert, ergab keine weitere Verringerung der Sinapatester im Rapssamen. Aus diesen Gründen konzentrierten wir uns auf die genomische Charakterisierung von UGT84A9, um Information für ein mögliches TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes) des Genes zu erhalten. Bei der Sequenzierung von UGT84A9 PCR-Klonen wurden zwei hauptsächliche Sequenztypen gefunden, Sequenztyp 1 und Sequenztyp 2. Durch RT-PCR und cDNA-AFLP konnte gezeigt werden, dass UGT84A9 Sequenztyp 1 der hauptsächlich exprimierte Sequenztyp ist. Vier verschiedene UGT84A9-Loci wurden im Genom von B. napus bei einer Restriktionsanalyse von genomischen BACs gefunden, UGT84A9a, UGT84A9b, UGT84A9c und UGT84A9d. Durch Sequenzanalysen konnte die Abstammung aller vier Loci aufgeklärt werden, UGT84A9a und –c stammen vom C-Genom (Brassica oleracea), UGT84A9b und –d vom A-Genom (Brassica rapa). Des Weiteren wurde gezeigt, dass UGT84A9a und –b zum Sequenztyp1 gehören, während UGT84A9c und –d dem Sequenztyp 2 entsprechen. Somit konnten UGT84A9a und –b als mögliche Ziele für ein TILLING identifiziert werden.