Die Regulation der Pyruvatdecarboxylasen aus den Schlauchpilzen Kluyveromyces lactis, Saccharomyces cerevisiae und Neurospora crassa

Abstract

In der vorgelegten Arbeit wird über die allgemeine Charakterisierung der Pyruvatdecarboxylase aus Neurospora crassa berichtet. Als Vorraussetzung für die kinetischen und strukturellen Untersuchungen an diesem Protein wurde ein Reinigungsprotokoll entwickelt. Im Weiteren wird die Substrataktivierung der beiden Pyruvatdecarboxylasen aus Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae näher beleuchtet. Zur Charakterisierung der Aktivierung wurden die beiden Substratanaloga Pyruvamid und Methylacetylphosphonat sowie das Substrat Pyruvat genutzt. Durch den kinetischen Vergleich der beiden Analoga sowie durch Kristallstrukturen der nativen KlPDC, der KlPDC im Komplex mit MAP, der ScPDCE477Q im Komplex mit Pyruvamid sowie der ScPDCD28A und der ScPDCE477Q im Komplex mit dem Substrat Pyruvat, konnte ein Signalübertragungsweg für die die allosterische Aktivierung von Hefe-Pyruvatdecarboxylasen aufgestellt werden. Er basiert auf einer kovalenten Bindung eines Effektors an Cys221 in Form eines Thiohemiketals als initialen Aktivierungsschritt. Als Folge dieser Interaktion, wird die flexible regulatorische Domäne mit der benachbarten α-Domäne verknüpft und somit fixiert. Dies ist wiederum die Ursache für die Fixierung und Neuanordnung des Loops 288-304 und anschließend des Loops 104-115. Erst durch die Fixierung und Umstrukturierung der beiden Histidine 114 und 115 wird das aktive Zentrum komplettiert. Mittels SAXS-Experimenten ließ sich eine globale Dimer-Dimer-Rotation von einem halbseitig geschlossenen zu einem offen Zustand als unmittelbare Folge der Substrataktivierung nachweisen. Zudem konnten die Ergebnisse UV/VISphotometrischer Messungen in Gegenwart von Pyruvat, MAP und Pyruvamid durch SAXS-Studien bestätigt werden.