Identification and charcterization of dominant suppressors of SUVH2 overexpressiomn in Arabidopsis thaliana

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war die Isolierung und Charakterisierung neuer Suppressoren, unter SUVH2-Überexpression. Diese Suppressoren sollen zur Identifikation von Genen führen die an der Regulierung der Chromatinstruktur in Arabidopsis thaliana beteiligt sind. Eine neuartige Strategie der T-DNA-Mutagenese wurde durch die Einführung einer zweiten T-DNA in die SUVH2 Überexpressions-Pflanzen erfolgreich etabliert. Diese Pflanzen sollten dazu dienen dominante Suppressor-Mutanten zu isolieren. Der erste Screen wurde mit heterozygoten Überexpressions-Pflanzen durchgeführt, da die homozygote Linie steril war. Durch die Verwendung von posttranskriptionellem Gen-Silencing konnten homozygote Überexpressionspflanzen in der F1-Generation erzeugt werden, die im zweiten T-DNA Mutagenese-Screen verwendet wurden. Neue Mutationen die einen dominanten Suppressor-Effekt auf die SUVH2 Überexpressionpflanzen haben konnten identifiziert werden und die flankierenden genomischen Sequenzen der T-DNA wurden durch I-PCR isoliert. Die meisten der identifizierten Loci waren bisher unbekannt, da sie nicht von anderen genetischen Screens identifiziert werden konnten. Basierend auf den immunzytologischen Daten wurden die Mutanten in zwei Gruppen eingeteilt. In der ersten wurde die ektopische Verteilung von H3K9me2 beibehalten während sie in der zweiten Gruppe zum wildtyp der SUVH2 Überexpression zurückkehrt. Der interessanteste Kandidat, der durch den genetischen Screen gefunden wurde, war eine Mutation eines Gens, das für ein bis dato unbekanntes Protein mit Bromodomäne codierte. Dieses Protein verdient weitere Aufmerksamkeit, vor allem da es eine Kernlokalisierungssequenz, eine Bromodomäne und ein mutmaßliches RNA-Bindungsmotiv besitzt. Kreuzungen mit dem kommerziell erhältlichen SALK-Stamm bestätigten die Suppressor-Effekte und die Insertionsstelle aller isolierten Mutanten. Zusammengefasst führte diese Arbeit zur Etablierung eines neuen genetischen Screens um dominante Suppressor-Mutationen zu isolieren die dabei helfen können die Signalkaskade die zur Bildung von Heterochromatin in Arabidopsis thaliana führt aufzuklären.