Optimierung einer mikrobiellen Transglutaminase mittels Sättigungsmutagenese und DNA-Shuffling

Abstract

Die mikrobielle Transglutaminase (MTG) ist ein Enzym, das in der Lage ist Proteine kovalent zu verknüpfen. Sie wird in unterschiedlichen industriellen Bereichen, z.B. der Lebensmittelindustrie, als Biokatalysator eingesetzt. Weiterhin kann die MTG für die Herstellung von Biopolymeren aus verschiedenen Proteinen genutzt werden. Für die Herstellung solcher Biopolymere z.B. mittels Extrusion wäre es vorteilhaft die Verknüpfungsreaktion bei höheren Temperaturen durchführen zu können. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war eine weitere Optimierung der MTG ausgehend von Aminosäure-Substitutionen, die mittels Random Mutagenese generiert und in einem Screening auf erhöhte Thermostabilität identifiziert wurden. Es wurde eine Sättigungsmutagenese an sieben thermostabilen Hot Spots durchgeführt. In einem Mikrotiterplatten-basierenden Screening wurden verschiedene Klonbibliotheken auf erhöhte Thermostabilität untersucht. Für vier Positionen konnten Aminosäure-Substitutionen identifiziert werden, die zu einer weiteren Steigerung der Thermostabilität führten. Mittels DNA-Shuffling wurden die Mutanten mit der höchsten Thermostabilität aus der Random Mutagenese und der Sättigungsmutagenese kombiniert. Es wurde eine Bibliothek von 1500 Klonen auf verbesserte Thermostabilität untersucht. Die thermostabilste MTG-Variante (Dreifachmutante S23V-Y24N-K294L) besitzt im Vergleich zum rekombinanten Wildtyp-Enzym eine 12-fach höhere Halbwertszeit bei 60 °C. Eine Mutante mit Aminosäure-Substitutionen an den Positionen 2, 289 und 294 besitzt ein Temperaturoptimum bei 60 °C, welches 10 °C höher als das des Wildtyp-Enzyms ist.