Identifizierung und Charakterisierung der Sinapinesterase aus Brassica napus sowie ihre Nutzung zur Modifikation des Sinapinstoffwechsels

Abstract

Samen vieler Brassicaceen akkumulieren bedeutende Mengen des löslichen Phenylpropanoids Sinapin (Sinapoylcholin). Während der Samenkeimung wird Sinapin durch die katalytische Aktivität einer Sinapinesterase hydrolysiert. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Identifizierung sowie die molekulare und biochemische Charakterisierung der Sinapinesterase BnSCE3 aus Raps (Brassica napus). Das Enzym wurde aus jungen Keimlingen von B. napus bis zur Homogenität aufgereinigt und parziell sequenziert. Durch Homologie-basierte Klonierung wurde eine vollständige cDNA der BnSCE3 isoliert. Sequenzanalysen zeigten, dass die BnSCE3 zur Enzymfamilie der GDSL-Lipasen gehört. In vitro Assays bestätigten für die BnSCE3 das für die Klasse der GDSL-Lipasen typische breite Spektrum potenzieller Substrate. Unter den getesteten Verbindungen zeigte die BnSCE3 die höchste katalytische Effizienz gegenüber Sinapin. Zusammen mit dem Genexpressionsprofil verweist dies auf eine physiologische Bedeutung der BnSCE3 als Sinapinesterase in der Pflanze. In Rapssamen ist Sinapin die dominierende antinutritive phenolische Verbindung und verhindert eine effiziente Nutzung des hochwertigen Samenproteins. Mit der samenspezifischen Überexpression der BnSCE3 wurde eine neuartige Strategie zur Sinapin-Absenkung entwickelt. Transgene BnSCE3-exprimierende Samen wiesen eine Verringerung des Sinapingehaltes um bis zu 94% im Vergleich zum Wildtyp auf. Die Untersuchung der Metabolitenprofile zeigte neben der drastischen Sinapinabsenkung globale Auswirkungen auf den Primär- und Sekundärstoffwechsel des Samens. Die wichtigsten agronomischen Eigenschaften – Öl-, Protein- und Glucosinolatgehalt – wiesen keine signifikanten Veränderungen auf.

Seeds of many brassicaceous plants accumulate high amounts of the soluble phenylpropanoid sinapine (sinapoylcholine). During early stages of seed germination sinapine is rapidly hydrolyzed by a sinapine esterase activity. From young seedlings of oilseed rape (Brassica napus) the sinapine esterase BnSCE3 was purified and characterized. Homology-based cloning led to the isolation of a full-length cDNA encoding BnSCE3. Sequence comparison identified BnSCE3 as a GDSL lipase like enzyme. In vitro assays of the BnSCE3 catalytic activity revealed a broad range of choline esters as potential substrates. Among these compounds, BnSCE3 showed highest catalytic efficiency with sinapine. Together with the expression profile, this indicates that BnSCE3 acts as a sinapine esterase in planta. In seeds of B. napus sinapine is the predominant phenolic compound in a complex group of antinutritive sinapate esters, which hamper the use of seed protein for food and feed. A strategy was developed to lower the sinapine content in B. napus by expressing the BnSCE3 gene under control of a seed-specific promoter. In transgenic BnSCE3 overexpressing seeds the sinapine content was less than 6% of the wild-type level. Metabolic profiling of transgenic seeds unraveled global effects on seed primary and secondary metabolism besides suppression of sinapine accumulation. The major agronomic traits like oil content, protein content and glucosinolate concentration were not altered.