Phospholiase D from Indian mustards seeds - purification and enzymatic characterization

Abstract

In vorliegender Dissertation wird erstmalig über die Reinigung und Charakterisierung von Phospholipase D (PLD) aus Senfsamen berichtet. Der kritische Schritt bei der Reinigung besteht in der Ca2+-vermittelten hydrophoben Chromatographie an Octyl-Sepharose bei Raumtemperatur. Die molekulare und biochemische Charakterisierung der PLD zeigt, dass das Enzym dem α-Typ der Pflanzen-PLDs zuzuordnen ist. Seine maximale Aktivität gegenüber Phosphatidylcholin (PC) war im mischmizellaren System 20-fach höher als im wässrig-organischen Zweiphasensystem. Das Enzym zeigte in beiden Systemen die gleiche Präferenz gegenüber verschiedenen Phospholipiden mit PC als dem bestem Substrat, gefolgt von Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylglycerol. Die PLD akzeptierte auch Alkohole für die Transphosphatidylierungsreaktion mit Ethanol als dem bevorzugten Alkohol vor Glycerol und Serin. Interessanterweise kann PLD Phosphatidylserin aus PC und L-Serin produzieren, aber nicht hydrolytisch spalten.

The present thesis is the first report on the purification and characterization of phospholipase D (PLD) from mustard seeds. The crucial step in the purification of the enzyme is the Ca2+-mediated hydrophobic interaction chromatography on Octyl-Sepharose at room temperature. The molecular and biochemical characterization of mustard PLD revealed that the enzyme belongs to α-type plant PLDs. Its maximum activity toward phosphatidylcholine (PC) was 20 fold higher in the mixed micellar system than in aqueous-organic two-phase system. The enzyme showed the same preference for the different phospholipids in both the assay systems with PC as the most favoured substrate followed by phosphatidylethanolamine and phosphatidylglycerol. The PLD also accepted natural alcohols for the transphosphatidylation reaction with ethanolamine as the best acceptor alcohol followed by glycerol and serine. Interestingly, the PLD can produce phosphatidylserine from PC and L-serine but it cannot cleave it.