Molecular genetic and biochemical interaction studies of the transcriptional activator Gal4 and its repressor Gal80 in Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis

Abstract

Der Galaktose-switch in Saccharomyces cerevisiae und Kluyveromyces lactis wird durch die Aktivität dreier Proteine reguliert, den Transkriptionsaktivator Gal4, den Repressor Gal80 und den Galaktosesensor Gal3/1. Es existieren zwei Modellvorstellungen, die diesen Galaktoseschalter beschreiben. Dem „Allosterischen Modell“ zufolge bilden Gal4, Gal80 und Gal3/1 bei Galaktose-Induktion einen trimären Komplex, der zur Aktivierung der GAL/LAC-Gene fähig ist. Beim „Dissoziationsmodell“ hingegen konkurrieren Gal3/1 und Gal4 um die Bindung an Gal80, was zu einer vollständigen Dissoziation des Gal3/1-Gal80 Komplexes vom Aktivator führt. In dieser Arbeit konnte mit Hilfe von Chromatin-Immunpräzipitations-Analysen (ChIP) in S. cerevisiae gezeigt werden, dass ScGal80 nur unter nicht-induzierenden Bedingungen an ScGal4 bindet. Die Zugabe von Galaktose führt zur Dissoziation des Repressors vom Aktivator. Eine Reassoziation der beiden Proteine erfolgt erst, nachdem die Galaktose im Medium aufgebraucht ist. Um in vitro-Studien mit den drei regulatorischen Proteinen aus K. lactis durchführen zu können, wurde ein Protokoll zur Expression und Reinigung von rekombinantem KlGal4 im Komplex mit KlGal80 entwickelt. Die Funktionalität dieses Komplexes wurde bestätigt. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von rekombinantem KlGal1 zu dem Komplex zur Dissoziation der beiden Proteine führt. Die Bildung eines trimären Komplexes wurde nicht beobachtet. Die in der vorliegenden Arbeit erzielten Ergebnisse stützen daher eindeutig das Dissoziationsmodell, sowohl für S. cerevisiae als auch für K. lactis.

The galactose genetic switch in Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis is conducted by the activity of three proteins, the transcriptional activator Gal4, the repressor Gal80 and the galactose sensing protein Gal3/1. According to the “allosteric model”, the formation of a ternary Gal4-Gal80-Gal3/1 complex leads to activation of GAL/LAC-gene transcription upon galactose induction. According to the “dissociation model”, Gal3/1 and Gal4 compete for the binding to Gal80, leading to dissociation of Gal3/1-bound Gal80 from the activator Gal4. In this work, Chromatin immunoprecipitation (ChIP) experiments in S. cerevisiae revealed that ScGal80 is bound to ScGal4 only under non-inducing conditions and that addition of galactose leads to a dissociation of the repressor and the activator. A reassociation of the two proteins occurs as soon as the galactose in the medium is depleted. For in vitro-studies with the three regulatory proteins from K. lactis a protocol for expression and purification of recombinant KlGal4 in complex with KlGal80 was developed. The functionality of this complex was demonstrated. It could be shown that addition of recombinant KlGal1 to the complex leads to dissociation of the two proteins. Ternary complex formation could not be observed. The results obtained in this work therefore strongly support the dissociation model for both yeasts.