Trypsin: eine Modellprotease für die Generierung neuer Biokatalysatoren

Abstract

Die Serinprotease Trypsin kommt natürlicherweise im Zwölffingerdarm von Säugetieren vor und katalysiert die hydrolytische Spaltung von Peptidketten nach den basischen Aminosäureresten Arginin oder Lysin. Dabei wird die Katalyse durch die für diese Proteasefamilie typische katalytische Triade aus D102-H57-S195 vermittelt. Im ersten Teil der angefertigten Dissertation wurde der sogenannte „99-er loop“ von Enteropeptidase, eine zu Trypsin strukturell verwandte Protease, auf Trypsin übertragen. Die generierte Trypsin-Variante S96K/N97R/T98R/L99K (EK-Trypsin) wurde auf die Übertragbarkeit der Spezifität von Enteropeptidase auf Trypsin untersucht. Die Spaltung von verschiedenen makromolekularen Substraten mit der entsprechenden Enteropeptidase-erkennungssequenz D-D-D-D-K durch EK-Trypsin zeigt, dass mit den eingeführten Aminosäuresubstitutionen die Spezifität auf Trypsin übertragen werden konnte. Im zweiten Teil der vorliegenden Dissertation wurde die Trypsinvariante K60E/N143H/Y151H/D189K strukturell charakterisiert. Diese Trypsinvariante ist neben der Proteolyse unter Verwendung von Substratmimetikas ebenso zur Peptid-Ligation (reverse Proteolyse) befähigt. Durch die Analyse von fünf verschiedenen Kristallformen dieser Trypsinvariante konnte gezeigt werden, dass diese in einer Zymogen-ähnlichen Konformation vorliegt und erst durch die Bindung der entsprechenden Substrate in eine aktiv-ähnliche Konformation überführt wird, wodurch die Katalyse ermöglicht wird. Durch diese Umwandlung zwischen zymogener und aktiver Protease wird die Peptid-Ligation im wässrigen Medium im Vergleich zur Hydrolyse bevorzugt.

The serine protease trypsin occurs in the duodenum of mammalians and catalyzes the hydrolytic cleavage of peptide chains after the basic amino acid residues arginine or lysine. Catalysis is achieved via the catalytic triad D102-H57-S195 typical for this protease family. In the first part of the dissertation, the so called “99-loop” of the structurally related enteropeptidase was transferred to trypsin. The generated trypsin variant EK-trypsin (S96K/N97R/T98R/L99K) was analyzed for the ability to transfer specificity from enteropeptidase to trypsin. The cleavage of various macromolecular substrates containing the corresponding enteropeptidase cleavage sequence D-D-D-D-K by EK trypsin shows that specificity determinants can be transferred between the two closely related enzymes. The second part deals with the structural characterization of the trypsin variant K60E/N143H/Y151H/D189K. In addition to proteolysis, this trypsin variant has the ability to ligate peptides (reverse proteolysis) through the use of mimetic substrates. Analysis of five different crystal forms shows that this variant exists predominantly in a zymogen-like conformation, and is converted into an active-like conformation upon binding of suitable substrates to allow catalysis. The reorganization between a zymogen- and an active-form of the modified protease facilitates a preference for the peptide ligation reaction in aqueous solution.