Die Rolle der vakuolären NHX-Transporter bei der Auslösung der Biosynthese von Benzophenanthridin-Alkaloiden in Eschscholzia californica

Abstract

Zellen von Eschscholzia californica reagieren auf Elicitor-Kontakt mit der Bildung von Benzophenanthridin-Alkaloiden. Der Signalweg der zur Expression von Biosynthese-Enzymen führt, beruht auf der Aktivierung einer Phospholipase A2 wodurch Lysophophatidylcholin (LPC) gebildet wird, welches als second messanger einen vakuolären H+-Efflux auslöst, der zur transienten Ansäuerung des Cytoplasmas führt. Die vorliegenden Ergebnisse demonstrieren, dass nur einer von vier in Eschscholzia identifizierten vakuolären Na+/H+-Transportern (NHX) diesen H+-Efflux vermittelt. RNAi-basiertes silencing der Isoformen EcNHX1, 3 und 4 resultiert in stabilen Zelllinien mit eingeschränkter Kapazität des Na+-abhängigen vakuolären H+-Efflux und der elicitor-ausgelösten Alkaloid-Überproduktion. Alle vier Isoformen komplementieren den Kapazitätsverlust einer Δnhx-Nullmutante von Saccharomyces bezüglich des Na+-abhängigen vakuolären H+-Efflux, aber nur der heterolog expremierte EcNHX1-Transporter ist durch LPC stimulierbar. Ein 3D Homologie-Modell bestätigt, dass nur die EcNHX1-Proteinsequenz eine potentielle LPC-Bindestelle aufweist.

Cell cultures of Eschscholzia californica react to a fungal elicitor by the overproduction of antimicrobial benzophenanthridine alkaloids. The signal chain towards the expression of biosynthetic enzymes includes a cytoplasmatic peak of lysophosphatidylcholine (LPC) by activation of phospholipase A2, followed by a transient vacuolar H+ efflux, resulting in a shift of cytosolic pH. The present study demonstrates that one of four vacuolar Na+/H+ antiporters (NHX) identified in Eschscholzia mediates this H+ flux. Simultaneous, RNAi-based silencing of EcNHX1, 3 and 4 resulted in stable cell strains with diminished capacities of Na+ dependent vacuolar H+ efflux and elicitor-triggered overproduction of alkaloids. Each of the EcNHX genes of Eschscholzia reconstituted the lack of Na+ dependent H+ efflux in a Δnhx null mutant of Saccharomyces, but only the yeast strain expressing EcNHX1 was stimulated by LPC. 3D homology models indicate that only EcNHX1 offers a plausible binding pocket for LPC and support the essential role of EcNHX1 in signal transfer between elicitor contact and gene activation by recruiting vacuolar H+ for the signaling process.