Selektion, Maturierung und strukturelle Charakterisierung von auf einem dimeren Ubiquitin-scaffold basierenden anti-ED-B Bindeproteinen und deren Fusion mit Interleukin-2

Abstract

Künstliche, scaffold-basierte Bindeproteine stellen für Therapie und Diagnostik eine Alternative zu Antikörpern dar. Auf der Oberfläche eines Ubiquitin-Dimers wurden Aminosäurepositionen für eine Randomisierung ausgewählt und eine entsprechende cDNA-Bibliothek konstruiert. In dieser Arbeit wurden daraus mittels phage display Bindeproteine gegen die Extradomäne-B (ED-B) des onkofetalen Fibronektins isoliert. Durch eine Maturierung mittels error-prone PCR wurden hoch affine und spezifische Bindeproteine generiert. Ausgewählte Bindeproteine wurden mit Interleukin-2 fusioniert, wobei die Affinität und die biologische Aktivität beider Komponenten erhalten blieb. Durch eine Röntgenstrukturanalyse von Bindeproteinen allein und in Komplex mit dem Targetprotein ED-B konnten die an der Bindung beteiligten Aminosäurereste identifiziert werden. Trotz der Vielzahl an ausgetauschten Aminosäureresten blieb in den Bindeproteinen die Ubiquitin-typische Struktur erhalten.

Artificial, scaffold-based binding proteins were developed as alternatives to antibodies for therapeutic and diagnostic use. Several surface exposed amino acid residues were chosen for randomization and a corresponding cDNA library was constructed. In this work, binding proteins against the extra-domain B (ED-B) of the oncofetal fibronectin were selected via phage display . By maturation via error-prone PCR highly specific binding proteins were generated. Genetic fusions of interleukin-2 and several binding proteins were produced. Both fusion partners retained affinity and biological activity. Binding proteins were analyzed by X-ray crystallography, individually and in complex with the target protein ED-B. Thus the binding mode and the amino acid residues involved in the interaction were identified. Despite numerous amino acid exchanges the typical ubiquitin fold was preserved.