Mass spectrometry-based methods for the analysis of proteins and protein complexes of neuronal model systems

Abstract

In dieser Arbeit wurden neuronale Systeme mit Massenspektrometrie (MS)-basierten Methoden untersucht. Hierfür wurde die Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y und aus Rattenhirn präparierte synaptische Vesikel ausgewählt. Die Proteome von SH-SY5Y Zellen sowie die durch zwei Differenzierungsprotokolle unter Verwendung von Retinsäure (RA) oder einer Kombination aus RA und Phorbol-12-Myristat-13-Acetat erhalten Zellen, wurden unter Anwendung einer MS-basierten markierungsfreien Quantifizierungsstrategie verglichen. Die chemische Quervernetzung mit Formaldehyd ermöglichte die Identifizierung von Proteininteraktionen. Kovalente Markierung wird verwendet, um lösungsmittelzugängliche Aminosäurereste von Proteinen zu identifizieren. In dieser Arbeit wurden chemische Markierungsstrategien etabliert und anschließend angewendet, um Proteine von synaptischen Vesikeln zu untersuchen. Diese Strategie ist anwendbar, um strukturelle Eigenschaften von Proteinen mit unbekannter Funktion zu identifizieren.

In this thesis, different neuronal systems were studied using mass spectrometry-based methods. More precisely, the neuroblastoma cell-line SH-SY5Y and synaptic vesicles purified from rat brain were selected. The proteomes of SH-SY5Y cells obtained under standard growth conditions and by two differentiation protocols employing retinoic acid (RA) or a combination of RA and phorbol-12-myristat-13-acetate were compared using a spectrometry-based label-free quantification approach. In-cell cross-linking using formaldehyde further allowed capturing protein interactions in various cellular organelles of SH-SY5Y cells. Covalent labeling is widely used to identify solvent accessible amino acid residues of proteins or protein complexes. In this thesis, chemical labeling strategies were employed and then applied to study proteins of synaptic vesicles. In conclusion, the labeling workflow is applicable to unravel structural properties of proteins with unknown function.