A simple technique for N-end rule-controlled conditional protein accumulation in vivo

Abstract

Gerichtete Steuerung von Proteinabundanz war immer ein vielversprechender Ansatz in der bio-medizinischen Grundlagenforschung. Eine Technik, welche in Hefe oftmals genutzt wurde war eine Temperatur-kontrollierbare Degradationssequenz, das so genannte N-degron. Im Rahmen dieser Arbeit wird ein optimiertes N-degron eingeführt und beschrieben, welches nun erlaubt die Vorteile der N-degron Technik auch in vielzelligen Organismen zu nutzen. Ich zeige die Anwendung in A.thaliana und D.melanogaster mit verschiedenen Zielproteinen und beschreibe und untersuche die Reaktionskinetiken des Systems. In einem zweiten Teil soll die Erkennung durch die für den Abbau zuständige E3 Ligase PRT,1 mittels einer peptidbasierten Screeningexperiments, verbessert und die Ergebnisse in Protoplasten und Hefe verifiziert werden. Als letztes werden auch erfolglose Experimente diskutiert, welche trotz alledem unser Verständnis der Degrontechnik vertiefen. Diese Arbeit stellt die erste vollständige und verbesserte Beschreibung des Degron-Verhaltens dar und diskutiert auch so wichtige Punkte wie den genauen Wirkungsmechanismus.

Control over protein abundance has long been a fruitful approach in bio-medical research. One approach that has been well-established in yeast, is a temperature-controlled degradation signal, the so-called N-degron. In this work an optimized N-degron is introduced and described, which now allows to benefit from the advantages oft he technique also in multicellular organisms. I demonstrate applicability in A.thaliana and D.melanogasterwith different target proteins and also elucidate and describe reaction kinetics oft he system. In a second part it was attempted to optimize the recognition through the responsible E3-ligase PRT1 using peptide arrays as well as verification in protoplasts and yeast. Last, also unsuccessful experiments are discussed that nevertheless shed light on the functionality oft he degron. This work represents the first complete and optimized description of N-degron behavior and also discusses important point about ist precise mode of action.