Energy landscapes of protein folding - from structure to function

Abstract

Proteine sind die funktionstragenden Moleküle in lebenden Zellen und deshalb auch wichtige Zielmoleküle in der Pharmazie und Biotechnologie. Um zu funktionieren, müssen sie eine definierte dreidimensionale Struktur annehmen. Die Abfolge der Aminosäuren, die Bausteine der Proteine, kodiert für diese bestimmte Konformation. Wie genau sich eine solche Polypeptidkette in ihre aktive Form faltet, ist eine essentielle Frage in der Strukturbiologie. Moderne, leistungsstarke Spektroskopiemethoden dienen dazu, diesen sogenannten Proteinfaltungsprozess aufzuklären. Hauptfokus der vorliegenden Arbeit waren Faltungsstudien an Ankyrin-Repeat-(AR)-Proteinen. Der AR ist ein weitverbreitetes Strukturmotiv in der Natur, vertreten in Proteinen aller Lebensformen. Ihre stark vereinfachte Architektur bietet dabei einen grossen Vorteil bei der Untersuchung ihrer Faltungswege. Im Gegensatz zu globulären Proteinen fehlen AR-Proteinen nämlich weitreichende Wechselwirkungen zur Stabilisierung. Dadurch können ermittelte Stabilitäten gewissen Strukturelementen zugeordnet werden, um so letzendlich Energielandschaften bestimmen zu können. Die umfangreiche biophysikalische Analyse des Faltungsmechanismuses von p19INK4d, bestehend aus fünf AR-Einheiten, zeigte eine kinetische Zwischenstufe während der Ent- und Rückfaltung auf. CD- und Fluoreszenz-detektierte Gleichgewichtsübergänge sowie komplexe zeitaufgelöste Faltungsanalysen von p19INK4d bestätigten einen sequentiellen Faltungsweg über diese hyperfluoreszierende Zwischenstufe (Intermediat). Detailierte Informationen über die Zwischenstufe von p19INK4d wurden durch die Einführung einer Glutamatmutation erhalten, die eine bereits beschriebene Phosphorylierung in p19INK4d nachahmt. Tatsächlich bestätigte eine ausführliche Analyse der NMR- und Fluoreszens-detektierten Gleichgewichtsmessungen und Kinetiken einer p19INK4D S76E-Mutante, dass die "Phosphorylierungsmutante" diesem zuvor entdeckten Faltungsintermediat entspricht, wobei die funktionellen ARs ungefaltet und AR 3 bis 5 gefaltet vorliegen. Bisher waren Faltungsstudien an natürlichen vorkommenden AR-Proteinen nur auf eukaryotische Proteine beschränkt. Um die allgemeine Gültigkeit eines AR-Faltungsmechanismuses zu überprüfen wurde deshalb ein neues AR-Protein in dem evolutionär älteren Organismus Thermoplasma volcanium identifiziert. Die Kristallstruktur zeigte, dass sich dieses archäische Protein (tANK) auch in fünf AR-Einheiten mit einer zusätzlichen Helix am N-Terminus faltet. Faltungsanalysen dieses Proteins offenbarten einen 3-Zustandsfaltungsweg mit einem schnellen Gleichgewicht zwischen dem nativen und intermediären Zustand, wie bereits für p19INK4d gezeigt. Strukturelle Informationen über das Intermediat von tANK resultieren aus NMR-Messungen, da es sich bis 90 % unter Gleichgewichtsbedingungen populieren lässt. Amidprotonen der AR-Einheiten 3-5 des Intermediats zeigten native chemische Verschiebungen, wohingegen die N-terminalen AR-Einheiten ungefaltet sind. Die Faltung der AR-Proteine scheint einem allgemeinen Prinzip zu folgen: Die stabilsten AR-Einheiten falten sich zuerst und bieten dann den weniger stabilen aber funktionellen AR-Einheiten ein Gerüst für deren Faltung. AR-Proteine haben bereits sehr früh in der Evolution ihrer charakteristischen Eigenschaften und Funktionen entwickelt. Mit zunehmender zellulärer Komplexität mussten sich die Organismen sehr schnell und effizient an die neuen Lebensbedingungen anpassen. Dies war durch die modulare Architektur der Repeat-Proteine leichter möglich, da einfache Mutationen, Deletionen, Insertionen oder Gendublikationen sehr schnell in einer grossen Vielzahl verschiedener gefalteter Proteine resutlierten um spezifische Funktionen übernehmen zu können.

Proteins are the vital molecules in living cells and important targets for pharmaceutical and biotechnological applications. To function they need a defined three-dimensional structure. All the information necessary for a protein to achieve this conformation is encoded in its amino acid sequence. To understand the process by which a polypeptide chain folds into its correct three-dimensional structure (the so-called "protein folding reaction") is an essential element in structural biology. In this work, protein folding studies of ankyrin repeat (AR) proteins were one of the major focus. The AR is a common motif in nature, present in all kingdoms of life. The architectural simplicity of those linear repeat proteins is a major advantage for studying protein folding reactions. Compared to globular proteins, repeat proteins lack long range interactions, allowing the dissection of energetics to different structural elements, which is required to construct energy landscapes. Folding studies of p19INK4d, an important inhibitor of the mammalian cell cycle, consisting of five sequentially arranged ARs, revealed a kinetic intermediate during unfolding and refolding. A global analysis of CD- and fluorescence detected equilibrium transitions and the complex un- and refolding kinetics of p19INK4d confirmed a sequential folding pathway including a hyperluorescent intermediate. High resolution information on this intermediate state of p19INK4d was obtained by mimicking the earlier described phosphorylation sites of p19INK4d by glutamate mutations. A detailed analysis of NMR and fluorescence detected equilibrium and kinetic data of the p19INK4d S76E mutant confirmed, that the phosphorylation mimicking mutant corresponds to the earlier detected folding intermediate with the functional ARs unfolded whereas AR 3-5 remain folded. Folding studies on naturally occurring AR proteins were until now only focused on eukaryotic proteins. To test the validity of a possible common mechanism of AR folding, a new AR protein in the evolutionary much older archaeal organism Thermoplasma volcanium was identified. The structure determined by X-ray crystallography confirmed that this archaeal protein (tANK) indeed folds into five sequentially arranged ARs with an additional helix at the N-terminus. Folding analysis if this protein revealed the same sequential three-state folding mechanism with the unusual fast equilibrium between the native and intermediate state as seen for p19INK4d. GdmCl induced equilibrium unfolding transitions monitored by NMR gave high resolution information on the intermediate state of tANK since it could be populated to more than 90 percent under equilibrium conditions. Amide protons of AR 3-5 in the intermediate showed nativ chemical shifts whereas the N-terminal ARs are unfolded. Folding of AR proteins seems to follow a common principle: the most stable ARs fold first and provide a scaffold for the subsequent folding of the less stable but functional repeats. Furthermore, AR proteins have evolved quite early in evolution their characteristic properties and functions, but the organisms at that time did not take advantage of this system, because they were far less complex than eukaryotic systems. Hence, with increasing cellular complexity, the organisms had to adopt quite efficiently and rapidly their protein repertoire to the new environmental conditions. This was possible with the modular architecture of repeat proteins, because simple mutations, deletions, insertions or dublications of these genes result in a large variety of folded and functional proteins, which can adapt easily their protein interfaces for specific functions.