Infrarotspektroskopische, strukturelle und kinetische Untersuchung der Pyruvatoxidase aus Lactobacillus plantarum

Abstract

Pyruvatoxidase (POX) aus L. plantarum enthält den Kofaktor Flavin-Adenin-Dinukleotid (FAD). Der normalerweise planare Isoalloxazinring des FAD liegt in POX in einer geknickten Konformation vor. Der Einfluss des Knicks auf die Eigenschaften des FAD wurde mit redoxinduzierter Fourier-Transform-Infrarot-Differenzspektroskopie am freien Kofaktor und anhand verschiedener Flavoproteine und POX-Varianten untersucht. Einige Banden im redoxinduzierten IRDifferenzspektrum des FAD konnten, ausgehend von einer dichtefunktionaltheoretischen Normalmodenanalyse verschiedener Lumiflavinspezies, entsprechenden Schwingungsmoden zugeordnet werden. Frequenzunterschiede einiger Moden zwischen enzymgebundenem und freiem FAD werden diskutiert. Die enzymkinetischen und IR-spektroskopischen Eigenschaften der POX-Variante V265A werden auf der Grundlage der in der Arbeit bestimmten Kristallstruktur betrachtet. POX enthält weiterhin den Kofaktor Thiamindiphosphat (ThDP). Die katalytische Funktion verschiedener Aminosäurereste in der Nähe des ThDP wurde bestimmt, indem die steady-state-Konzentrationen der ThDP-Reaktionsintermediate für verschiedene POX-Varianten ermittelt wurden. Weiterhin wurden die Spezifität der POX hinsichtlich des Substrates Phosphat sowie die Kopplung des Elektronentransfers mit der Übertragung des Acetylrestes vom Acetyl-ThDP auf Phosphat oder andere Nukleophile untersucht.

Pyruvate oxidase (POX) from L. plantarum contains the cofactor flavin-adeninedinucleotide (FAD). The isoalloxazine ring of FAD is normally planar, yet is found in a bent conformation in POX. The effect of this bend on the properties of FAD was investigated by redox-induced Fourier-Transform-Infrared difference spectroscopy, using the free cofactor and several flavoproteins and POX variants. Some bands of the redox-induced IR difference spectra could be assigned to vibrational modes, based on a normal mode analysis of several lumiflavin species, using a density functional theoretical approach. Frequency differences of some modes between free and enzymebound FAD are discussed. Enzyme kinetical and IR-spectroscopic properties of the POX variant V265A are explained on the basis of the crystal structure which has been determined in the present work. The second cofactor of POX is thiamin diphosphate (ThDP). The catalytic function of several amino acid residues in the vicinity of ThDP was determined by measuring steady state concentrations of ThDP reaction intermediates for a number of POX variants. Furthermore, the specificity of POX regarding the substrate phosphate and the coupling of the electron transfer step with the transfer of the acetyl moiety from acetyl-ThDP to phosphate or other nucleophiles were investigated.