Fluorescent fusions of key enzymes of plant fatty acid modification : functionality and localization

Abstract

Ungesättigte Fettsäuren beeinflussen die physiologische Funktion von Membranen und werden in Triacylglycerin (TAG) eingebaut. Dabei scheint die subzelluläre Lokalisation der beteiligten Enzyme eine wichtige Rolle zu spielen. Fluoreszenzmarkierte Varianten von FAD2 und FAD3 wurden generiert und erwiesen sich in Hefeexperimenten und in Komplementationsanalysen von Arabidopsis-Mutanten als funktional. EYFP-FAD2 dekorierte donutförmige Strukturen in verschiedenen Pflanzengeweben. Die Koexpression in Protoplasten mit verschiedenen Organellenmarkern brachte diese Strukturen mit ER-assoziierten Golgi-Partikeln in Verbindung. EYFP-FAD3 assoziierte mit dem ER. Die Expression von FAD3 unter der Kontrolle des endogenen Promotors wurde durch Koexpression mit dem Transkriptionsfaktor WRI1 verstärkt. Hefe-Zwei-Hybrid-Analysen zeigten neue Interaktionen von FAD2 und FAD3 mit PDAT, DGAT1 und DGAT2. Fluoreszenzmarkierte Varianten von PDAT und DGAT1 erwiesen sich in Hefe als funktional und zeigten eine ER-assoziation in Protoplasten. BiFC-Analysen bestätigten die Interaktionen und legten die ER-Membran als Ort der Interaktion nahe.

Unsaturated fatty acids influence the physiological function of membranes and are incorporated into triacylglycerol (TAG). Previous research indicates that the subcellular distribution of the enzymes involved in fatty acid desaturation and TAG assembly plays an important role. Fluorescent fusions of FAD2 and FAD3 were generated and proved functional in yeast experiments and in Arabidopsis mutant complementation analyses. EYFP-FAD2 decorated donut-shaped structures in different plant tissues. Coexpression in protoplasts with different organelle markers correlated these structures with ER-associated Golgi-particles. EYFP-FAD3 associated with the ER network. The expression of FAD3 under the control of its endogenous promoter was enhanced by coexpression with the transcription factor WRINKLED1. Yeast two-hybrid interaction analyses revealed novel interactions of FAD2 and FAD3 with PDAT, DGAT1 and DGAT2. Fluorescence-tagged variants of PDAT and DGAT1 proved functional in yeast. Localization analyses revealed an ER-association of PDAT and DGAT1. BiFC analyses verified the interactions and suggested the ER membrane as site of interaction.