Produktion von rekombinantem, humanem Tropoelastin (Isoform 2) und in vitro Hydroxylierung mittels viraler Prolyl-4-Hydroxylase

Abstract

Im Rahmen der Arbeit wurde ein reproduzierbares Produktionsprotokoll für humanes Tropoelastin (Isoform 2) im Bioreaktor etabliert und erfolgreich auf ein Kulturvolumen von 100 L übertragen. Das Tropoelastin wurde aus der E. coli-Biofeuchtmasse mittels acetonhaltigem Gemisch extrahiert und mittels neuer Methode chromatographisch gereinigt. Es wurden insgesamt 137,5 ± 12,5 mg Tropoelastin/LKulturvolumen (n = 2) produziert (Proteinreinheit: > 99 %). Erstmalig wurde rekombinantes Tropoelastin mittels rekombinanter, viraler Prolyl-4-Hydroxylase in vitro hydroxyliert. Die Enzymaktivität wurde über den Sauerstoffverbrauch nachgewiesen. Die modifizierten Prolyl-Reste wurden massenspektrometrisch identifiziert, wobei sich eine geringe Substratspezifität der Hydroxylase zeigte. Die Arbeit leistet einen Beitrag zur Entwicklung neuer modifizierter Proteine, die beispielweise zur Herstellung von nativ-ähnlichen, elastinbasierten Biomaterialien für die medizinische Anwendung genutzt werden können.

In this study, a reproducible protocol for production of human tropoelastin (isoform 2) in bioreactor scale was established and was successfully transferred to 100 L culture volume. Tropoelastin was extracted from E. coli bio wet mass using an aceton mixture and was further purified by new chromatography method. In total, 137.5 ± 12,5 mg tropoelastin per liter of culture volume (n = 2) were produced (purity: > 99 %). For the first time, recombinant tropoelastin was in vitro hydroxylated by using a recombinant viral prolyl 4 hydroxylase. Enzyme activity was determined by oxygen consumption. Modified prolyl residues were identified by mass spectrometry revealing a rather broad hydroxylase substrate specificity under the tested conditions. This work contributes to the development of new modified proteins, e.g. for the production of elastin-based biomaterials in medical application with properties similar to native elastin.