Optimierung von Fermentationsprozessen zur Herstellung rekombinanter, spezifisch und unspezifisch isotopenmarkierter G-Protein-gekoppelter Rezeptoren in Escherichia coli

Abstract

Aufgrund der Assoziation von G-Protein gekoppelten Rezeptoren mit einer Vielzahl schwerwiegender Krankheiten ist die Charakterisierung dieser Proteine und des Mechanismus der Signaltransduktion für ein gezieltes Design von Pharmazeutika von hohem Interesse. Die Charakterisierung wird jedoch durch geringe Ausbeuten der rekombinanten Expression erschwert. Zudem ist eine strukturelle Analyse von GPCRs mittels NMR-Spektroskopie, die eine Untersuchung der flexiblen Strukturen und der Dynamik von Proteinen zulässt, mit der Inkorporation stabiler Isotope (15N, 13C) verbunden. Die vorliegende Arbeit ermittelte die reproduzierbare, optimale Expression isotopenmarkierter GPCRs in inaktiver und funktionaler Form in Escherichia coli. Die maximale Ausbeute des inaktiv exprimierten Neuropeptid Y-Rezeptors Typ 2 lag bei 35 mg/L Medium und die des funktional exprimierten Cannabinoid-Rezeptors Typ 2 bei 2 mg/L Medium mit einer Effizienz der spezifischen und unspezifischen Isotopenmarkierungen von >95%.