Rekombinante Herstellung, Renaturierung und biophysikalische Charakterisierung des humanen Glucagon-like Peptide-1 Rezeptors

Abstract

Der humane Glucagon-like Peptide-1 Rezeptor (GLP-1R) gehört zur Sekretinklasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Bindung diverser Liganden führt zur Aktivierung des Rezeptors mit anschließender Signalkaskade, welche wiederum die Ausschüttung von Insulin aus β-pankreatischen Zellen verursacht. Dieser Prozess ist an die Aufnahme von Glukose gekoppelt und auch in Patienten mit Diabetes mellitus Typ-2 erhalten. Durch die Erforschung der insulinotropen Eigenschaften von GLP-1 und Analoga wurden neue Therapieansätze für diese Stoffwechselkrankheit möglich. Für eine biophysikalische Charakterisierung des Rezeptors in vitro, wurde dieser zunächst in E.coli in Form von inclusion bodies exprimiert. Nach Reinigung des Proteins erfolgte dessen Rückfaltung unter Austausch des denaturienden Detergenz SDS gegen Brij 78 mit Hilfe des artificial chaperon systems. Anhand von Fern-UV CD-Spekten konnte gezeigt werden, dass der Brij78 solubilisierte Rezeptor eine charakteristische alpha-helikale Struktur ausbildet. Der Nachweis zur Fähigkeit der Ligandenbindung des renaturierten Rezeptors erfolgte mittels Fluoreszenz-Quenching und Biacore-Experimenten. Hierbei konnten apparente Dissoziationskonstanten von ca. 100 nM ermittelt werden. Um den Beweis zu erbringen, dass die gemessenen Effekte nicht ausschließlich auf die Funktion der N-terminale Domäne des Rezeptors (nGLP-1R), sondern auch auf zusätzliche Kontakte der Liganden mit den Transmembranhelixes und Loop-Regionen zurückzuführen sind, wurde die N-terminale Domäne separat untersucht. Dabei wurden Reinigung und Rückfaltung analog zum Gesamtrezeptor durchgeführt. Die anschließenden Untersuchungen ergaben, dass nGLP-1R Exendin-4 mit geringerer Affinität bindet als der Gesamtrezeptor. Mit der vorgelegten Arbeit konnte gezeigt werden, dass die rekombinante Expression, Reinigung und Renaturierung des humanen GLP-1-Rezeptors zu funktionellem Protein führt.