Etablierung der humanen Myt1 Kinase als Zielstruktur moderner Arzneistoffentwicklung - Beiträge zu Expression und Assayentwicklung

Abstract

In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Entwicklung zweier Testsysteme zur Aktivitätsbestimmung der beiden Wee Kinasen, Myt1 und Wee1. Methode 1 basiert auf einer Trennung von Substrat und Produkt mittels Kapillarelektrophorese (CE) und anschließender Fluoreszenzdetektion. Die zweite Methode wird durch einen Fluoreszenzpolarisations (FP) Immunoassay gebildet. Als Substrat der Kinasen wurden synthetische CDC2-abgewandelte un- / phosphorylierte Peptide eingesetzt. Für die CE Methode erfolgte eine Markierung der Peptide mit dem Fluoreszenzmarker 4-Fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan, für die FP Methode mit Fluorescein-5-maleimid. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit lag im biotechnologischen und biochemischen Bereich, der sowohl Upstream- als auch Downstream-Prozesse einschließt. Für eine Expression der Myt1 Kinase in E. coli wurden verschiedene Expressionsstämme und Vektoren eingesetzt. Die Aktivitätsbestimmung der gewonnenen Enzymlösungen erfolgte mit den entwickelten Methoden. Neben Enzympräparationen aus bakteriellen Expressionen wurden auch Myt1- und Wee1-Präparationen aus Insektenzellen getestet.