Identifizierung und Charakterisierung neuer Substrate des N-end rule pathways in Arabidopsis thaliana

Abstract

Proteine spielen eine zentrale Rolle in jedem Organismus, daher ist ihre Regulation von großer Bedeutung für die Gesamthomöostase der Zelle. Das Ubiquitin-Proteasomsystem (UPS) ist eines der Hauptregulationssysteme welches zum Beispiel fehlgefaltene oder nicht länger benötigte Proteine abbaut. Der N-end rule pathway korreliert die in vivo Halbwertszeit direkt mit dem präsentierten N-Terminus des Proteins und ist ein Teil des UPS. Bisher sind in Pflanzen nur wenige, Komponenten und Substrate des N-end rule pathways bekannt. Mit Hilfe von 2D-Gelelektrophorese und Shotgun, konnten über 50 Proteine gefunden werden, welche höher abundant in Mutanten des N-end rule pathways waren im Vergleich zum Wildtyp. Nach Validierung der N-Termini wurden zwei potentielle Substrate näher mit Hilfe von Interaktionsexperimenten im Protoplastensystem weiter charakterisiert. Diese Untersuchungen lassen die Vermutung zu, dass es sich bei der Cysteinprotease RD21a um das erste potentielle Substrat des Arginylierungszweiges des N-end rule pathways handelt, welches nicht mit MC beginnt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Protein RIN4, welches als N-end rule Substrat diskutiert wird und in gängigen Datenbanken wie TAIR zu finden ist, wahrscheinlich kein Substrat darstellt.

Regulation of protein homeostasis is crucial for the appropriate functioning and maintenance of every living cell. Therefore, spatial and functional control over protein abundance and activity is tightly regulated. One key regulatory system of protein homeostasis is the Ubiquitin Proteasome System (UPS) which is heavily involved in targeted protein degradation of e.g. unneeded or misfolded proteins. The N-end rule pathway, as a specialized branch of the UPS, correlates the in vivo half-life of a protein directly to its presented N-terminus. Until now, only very few components or substrates of the N-end rule pathway have been described in plants. Through application of comparative 2D gel electrophoresis and shotgun analysis, more than 50 proteins identified, which showed a higher abundance in mutants of the N-end rule pathway in comparison to their wild type counterpart. After validation of the in vivo N-termini, two potential new substrates were further characterized by interaction experiments through various means including Arabidopsis protoplasts. This study suggest that the cysteine protease RD21a is the first potential substrate of the arginylation branch of the N-end rule pathway which doesn’t start with MC at its N-terminus. Furthermore, it was demonstrated, that the protein RIN4, which has long been discussed as an N-end rule substrate with common databases such as TAIR even listing it as such, is probably not a substrate.