Identifizierung und rekombinante Herstellung von Phospholipase D-Isoenzymen aus Weißkohl (Brassica oleracea var. capitata)

Abstract

Phospholipase D (PLD) katalysiert die Hydrolyse von Glycerophospholipiden, wobei Phosphatidsäure und eine freie alkoholische Kopfgruppe entstehen. In Gegenwart eines anderen geeigneten Alkohols kann PLD den Phosphatidylrest durch eine sogenannte Transphosphatidylierungsreaktion auch auf diesen Alkohol übertragen. In Weißkohl konnten zwei PLD-Isoenzyme, PLD1 und PLD2, identifiziert und deren Gene sequenziert werden. Diese bestehen aus 3404 bzw. 3614 bp und enthalten drei Introns. Aufgrund der genomischen Struktur sowie der Aminosäuresequenz können PLD1 und PLD2 dem α-Typ der pflanzlichen PLDs zugeordnet werden. Wie in anderen Pflanzen-PLDs konnten auch hier zwei HKD-Motive und die C2-Domäne mit dem Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat-bindenden Motiv identifiziert werden. Erste Expressionsstudien in E. coli wurden mit der cDNA von PLD1 beginnend durchgeführt. Während Konstrukte, die StrepTactin oder Glutathion-Tags enthielten, keine befriedigenden Ergebnisse lieferten, konnte ohne Tags lösliches aktives Protein erhalten werden. Das pld2-Gen konnte auf die gleiche Weise rekombinant in E. coli exprimiert werden. Beide Enzyme wurden mittels Ca2+-abhängiger hydrophober Interaktionschromatografie gereinigt. Rekombinante PLD1 und PLD2 zeigten höchste Hydrolyseaktivitäten jeweils bei pH 5,5-5,6, unabhängig von der Ca2+-Konzentration (10-100 mM). Die optimale Ca2+-Konzentration betrug 45 mM für PLD1 und PLD2. Beide Enzyme zeigten vergleichbare Aktivitäten bei der Hydrolyse und Transphosphatidylierung von Phospholipiden.

Phospholipase D (PLD) catalyzes the hydrolysis of glycerophospholipids under formation of phosphatidic acid and a free alcoholic head group. In the presence of another suitable alcohol, PLD is also able to transfer the phosphatidyl moiety to this alcohol in a so-called transphosphatidylation reaction. In white cabbage, two PLD isoenzymes, PLD1 and PLD2, could be identified. The genes consist of 3404 and 3614 bp and contain three introns. Due to their genomic structure as well as the amino acid sequence, PLD1 and PLD2 can be assigned to the α-type of plant PLDs. Like in other plant PLDs, two HKD motifs and the C2 domain with a phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate binding motif could be identified. Starting from a cDNA of PLD1, expression studies in E. coli were performed. While constructs using StrepTactin and glutathione S-transferase tags yielded no satisfying results, soluble active enzyme was obtained without any tags. The pld2 gene could be expressed in the same way. Both enzymes were purified by Ca2+-mediated hydrophobic interaction chromatography. Both recombinant enzymes showed highest hydrolytic activities at pH 5.5 to 5.6, independent of the Ca2+ concentration (10-100 mM). The optimum Ca2+ concentration was 45 mM for PLD1 and PLD2. Both enzymes showed comparable activities in hydrolysis and transphosphatidylation of phospholipids.