Breaking the silence - Untersuchung des antiviralen RNA-silencings in einem pflanzlichen in vitro System

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde das RISC-vermittelte antivirale RNA-silencing untersucht. Dieser Mechanismus ist ein wichtiger Bestandteil der pflanzlichen Immunantwort gegen (+)RNA-Viren. In früheren Arbeiten wurde bereits gezeigt, dass sowohl das mRNA-silencing als auch die Replikation von RNA-Viren in einem zytoplasmatischen Extrakt aus Tabakzellen (BYL) rekonstituiert werden können. In der vorliegenden Arbeit wurden die Eigenschaften des BYL-Systems verwendet, um das siRNA-vermittelte antivirale RNA-silencing in vitro zu untersuchen. Dabei wurden verschiedene AGO-Proteine identifiziert, die eine effiziente Spaltung viraler target-RNAs vermitteln und somit eine potentielle antivirale Aktivität besitzen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass RISCs während der viralen Replikation ausschließlich zu einer Spaltung der viralen (+)RNA, nicht aber des viralen (-)RNA-Replikationsintermediates führen. Zusätzlich wurden verschiedene vsiRNA-target sites in einem definierten viralen RNA-Element identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass diese vsiRNAs sowohl in vitro als auch in vivo eine antivirale Aktivität besitzen.

In this study RISC-mediated antiviral RNA silencing, an important component of the plant’s immune response against RNA virus infections was recapitulated in vitro. Cytoplasmic extract of tobacco cells (BYL) was earlier shown to support mRNA silencing as well as viral RNA replication. In this study we integrated the two potentialities of the BYL system and in this way reproduced siRNA-directed antiviral RNA silencing in vitro. The system was subsequently used to identify those AGO proteins that support efficient RNA cleavage and thus have the capacity to act antivirally. Along the same line we showed that RISC exclusively targets the viral (+)RNA but not (-)RNA that is generated as a viral replication intermediate. Finally, we identified particularly accessible vsiRNA target sites in a defined viral element. We showed that these vsiRNAs act antivirally in vitro and in vivo.