Molekulare Funktionen von Metallionen bei der Aktivierung pflanzlicher Phospholipase D

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die calciumabhängige Aktivierung der PLDα (Phosphatidylcholinphosphatidohydrolase, PLD, E.C. 3.1.4.4) aus Weißkohl sowie die Substratinteraktion des Enzyms näher zu charakterisieren. Hierbei wurden neben dem natürlichen PLDα-Aktivator Calcium verschiedene Ionen der Seltenen Erden (Ln3+) auf ihre Fähigkeit untersucht das Enzym zu aktivieren. Aufschlüsse über Aktivierungsmechanismus und Katalyse erbrachte der Vergleich der Dissoziationskonstanten der Ln3+ untereinander sowie der bei Zugabe von Calcium ermittelten Werte. Die im Fokus stehende PLDα wurde mit der ebenfalls aus Weißkohl stammenden PLDγ hinsichtlich des Metallionenaktivierungsverhalten verglichen. Hierzu wurde das PLDγ-Gen (Genbank Bezeichnung: EU591736) erstmals in E. coli exprimiert und das Enzym anschließend gereinigt. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Untersuchungen über die Wechselwirkungen von PLDα und PLD aus Streptomyces sp. mit Substratmizellen durchgeführt. Dynamische Lichtstreu- und Röntgenkleinwinkelstreuexperimente lieferten Informationen zum hydrodynamischen Radius sowie zur Form und Struktur der Substratmizellen.

In the present thesis, the effect of PIP2 on the well-known α-type PLD isoenzyme 2 from cabbage (called PLDα), the interplay of this effect with the presence of metal ions, and the competition of different metal ions such as Tb3+ and Mg2+ ions with Ca2+ ions have been analyzed in a micellar system containing phosphatidyl-p-nitrophenol as substrate. The influence of micelle-forming detergents such as Triton X-100 and sodium dodecyl sulphate on the activity of PLDα and the activity of PLD from Streptomyces sp. have been compared and related to the micelle size as determined by dynamic light scattering and small angle x-ray scattering.